单颗粒生物探针及其等离子体生物存储器的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种单颗粒生物探针及其等离子体生物存储器的构建方法，其包括如下步骤：分别制备金银核壳纳米立方体(Au@AgNCs)溶胶和tsDNA溶液，并将所述Au@AgNCs固定于氧化铟锡导电膜玻璃表面；将所述tsDNA溶液滴加到固定有Au@AgNCs的氧化铟锡导电膜玻璃表面，室温下孵育后，用超纯水洗涤，并用氮气吹干，得到所述基于tsDNA的单颗粒LSPR探针。与银纳米立方体相比，Au@AgNCs具有相似的等离子体特性且结构更佳稳定；与一维结构的单链DNA分子以及二维结构的发夹型DNA分子相比，三维结构的tsDNA具有更好的刚性、结构稳定性以及易于多功能化等优点。

Single particle biological probe and construction method of plasma biological memory

The invention provides a single particle biological probe and a method for the construction of a plasma biological memory, which includes the following steps: preparing the gold and silver core shell nanometers (Au@AgNCs) sols and the tsDNA solution, and fixing the Au@AgNCs to the glass surface surface of the indium tin oxide conductive film, and adding the tsDNA solution to the fixed Au@A After incubating at room temperature, gNCs's indium tin oxide conductive film is incubated at room temperature, and the single particle LSPR probe based on tsDNA is obtained by washing with ultra pure water and blowing dry with nitrogen. Compared with the silver nanometers, Au@AgNCs has similar plasma characteristics and better stability. Compared with the single strand DNA molecule and the hairpin DNA molecule in the two-dimensional structure, the three-dimensional structure of tsDNA has the advantages of better rigidity, structural stability and easy to multifunction.

【技术实现步骤摘要】
单颗粒生物探针及其等离子体生物存储器的构建方法
本专利技术涉及一种基于tsDNA(四面体结构DNA)的单颗粒LSPR(局域表面等离子体共振)探针的构建方法及其用途，属于生物检测

技术介绍
MicroRNAs是一类长度在20～24个核苷酸的内源性非蛋白编码的RNAs，通常在早期发育，细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程中起着非常重要的作用。MicroRNAs的异常表达发生在癌症前期的恶性肿瘤细胞中，与许多癌症(如：肺、肝细胞、大肠和乳腺癌等)相关。MicroRNA-21(miR-21)存在于上述许多人类的癌症组织中，尤其在肺鳞癌组织中表达水平是正常组织中的2倍之多。因此，microRNAs可以作为生物标志物用于早期癌症的诊断和预后治疗。发展一种高灵敏的分析方法跟踪检测microRNAs用于早期癌症诊断对于生物学和诊断学是至关重要的。在许多生物系统中，单分子水平的研究可以揭示分子间的相互作用、动力学以及构象的细微变化。目前用于单分子水平检测的可行方法通常需要荧光分子作标记，然而荧光探针容易发生光漂白等现象且信噪比较低。近些年来，由于其独特的依赖于尺寸、形貌、组分和微环境的光学性质，等离子体在化学和生物传感领域引起了广泛的研究兴趣。这些传感器基于贵金属纳米颗粒(如：金纳米颗粒和银纳米颗粒)的LSPR特性，通过颗粒的LSPR峰(λmax)的移动作为检测信号。LSPR传感器用于测量金属纳米颗粒表面的分子间相互作用引起了研究者们的关注。许多不同的用于固定生物分子到金属纳米颗粒表面的方法也被广泛的报道。并且，从单个金属纳米颗粒获得的信号可以提供更加详细的信息。因此，我们希望基于单个纳米颗粒水平来检测金属纳米颗粒表面的生物分子间的相互作用。然而，由于microRNAs含量低，采用基于简单的ssDNA修饰的单个金属纳米颗粒形成的探针分子构建的等离子体纳米生物传感器对miR-21的检测限只能到1fM，同时，现有的信息存储设备的体积较大，尚有较大的改进空间。
技术实现思路
技术问题：本专利技术的目的是针对现有技术中的缺陷，提供一种单颗粒生物探针及其等离子体生物存储器的构建方法，与银纳米立方体相比，Au@AgNCs具有相似的等离子体特性且结构更佳稳定；与一维结构的单链DNA分子以及二维结构的发夹型DNA分子相比，三维结构的tsDNA具有更好的刚性、结构稳定性以及易于多功能化等优点。技术方案：本专利技术的一种单颗粒生物探针的构建方法是基于tsDNA的单颗粒LSPR探针的构建方法，其包括如下步骤：1).分别制备金银核壳纳米立方体Au@AgNCs溶胶和四面体结构DNA溶液，并将所述Au@AgNCs固定于氧化铟锡导电膜玻璃表面；2).将所述四面体结构DNA溶液滴加到固定有Au@AgNCs的氧化铟锡导电膜玻璃表面，室温下孵育2～6h后，用超纯水洗涤，并用氮气吹干，得到基于四面体结构DNA即tsDNA的单颗粒LSPR探针，即单颗粒局域表面等离子体共振探针。其中，所述Au@AgNCs溶胶的制备方法包括如下步骤：1.1).合成纳米金种子；1.2).将所述纳米金种子与十六烷基三甲基氯化铵进行反应，得到金溶胶；1.3).将所述金溶胶与抗坏血酸在40～80℃下进行反应后，加入硝酸银，反应后得到Au@AgNCs溶胶。所述Au@AgNCs固定于氧化铟锡导电膜玻璃表面的方法为：将氧化铟锡导电膜玻璃的表面清洗干净后，浸入到Au@AgNCs溶胶中，静置1～5min后取出，用超纯水清洗并用氮气吹干。所述四面体结构DNA溶液的制备方法包括如下步骤：将各条单链DNA溶解，在紫外分光光度计下测定220～280nm处的吸收，并参考每条单链DNA的摩尔消光系数，确定其浓度；将四条单链DNA以等比例混合于Tris-镁盐缓冲液中，加入三(2-羧乙基)膦后，转入聚合酶链式反应仪中，在90～98℃下持续10～15min后，迅速降温至～5℃，得到tsDNA溶液。本专利技术的单颗粒生物探针构建等离子体生物存储器的方法，包括如下步骤：利用所述单颗粒生物探针对不同的靶分子进行识别，Au@AgNCs表面tsDNA的构象会发生相应的变化，引起颗粒颜色及其LSPR散射光谱发生相应的改变，形成不同存储状态；以不同的所述存储状态代表不同输出值，通过译码装置将信息以若干输出值组合的形式进行编译，得到所述等离子体生物存储器。其中，所述靶分子为miR-21、核酸内切酶KpnI或核酸内切酶StuI。所述存储状态的确定方法为：定义单个Au@AgNC-tsDNA探针分子LSPR散射λmax的红移量作为输出；当不存在靶分子时，Au@AgNC-tsDNA探针分子的LSPR散射λmax基本保持不变，对应的输出值为0，此时tsDNA的结构处于“拉紧”的T0状态，作为生物存储器的初始状态；当加入1pM的靶分子miR-21后，Au@AgNC-tsDNA探针分子识别靶分子miR-21引起了Au@AgNC-tsDNA探针分子LSPR散射λmax发生31nm的红移，对应的输出值为3，此时tsDNA-miR-21的结构处于“拉紧”的T3状态；当核酸内切酶KpnI或核酸内切酶StuI存在时，Au@AgNC-tsDNA-miR-21纳米复合物的LSPR散射λmax相应的蓝移到稳定的状态，对应的输出值为2，此时tsDNA-miR-21的结构相应的处于“松弛”的R2状态和R3状态；当核酸内切酶KpnI和核酸内切酶StuI同时存在时，Au@AgNC-tsDNA-miR-21纳米复合物的LSPR散射λmax进一步蓝移至13nm，对应的输出值为1，此时tsDNA-miR-21的结构相应的处于“松弛”的R2/3状态。本专利技术的基本原理在于：采用tsDNA作为支架，构建“自下而上”的单颗粒LSPR探针，在纳米尺度内控制探针之间的距离、探针取向。在此，基于tsDNA修饰的单颗粒Au@AgNC探针设计了等离子体纳米生物传感器用于单分子水平miR-21和核酸内切酶(KpnI和StuI)活性检测。对于靶分子miR-21的检测原理如图1所示，当靶分子miR-21与tsDNA分子发生杂交反应，靶分子miR-21会取代Au@AgNCs表面的水分子，由于RNA分子的折射率(RI)大于水分子的RI导致Au@AgNCs表面RI的增大，从而引起Au@AgNC-tsDNA探针分子LSPR散射峰的红移，以此作为信号实现对靶分子miR-21的检测。图2给出了基于Au@AgNC-tsDNA17-miR-21纳米复合物的核酸内切酶活性检测的示意图。从图中可以看出，当加入核酸内切酶KpnI或StuI后，tsDNA17的边会被破坏，此时tsDNA17边上DNA分子的位置就会被周围的水分子取代，导致颗粒表面RI的减小，引起探针分子的LSPR散射λmax发生蓝移，实现对核酸内切酶的检测。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：1、与AgNCs相比，Au@AgNCs具有相似的等离子体特性且结构更佳稳定；2、三维结构的tsDNA与一维结构的ssDNA以及二维结构的发夹型DNA相比，具有很强的刚性，可以在颗粒表面呈直立的状态；空间定位能力强，可以提高物质传质速率；并且，能够精确控制探针间的距离，提高靶分子与捕获探针的结合效率以及易于多功能化等优点。用三维结构的tsDNA代替直连本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单颗粒生物探针的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1).分别制备金银核壳纳米立方体Au@AgNCs溶胶和四面体结构DNA溶液，并将所述Au@AgNCs固定于氧化铟锡导电膜玻璃表面；2).将所述四面体结构DNA溶液滴加到固定有Au@AgNCs的氧化铟锡导电膜玻璃表面，室温下孵育2～6h后，用超纯水洗涤，并用氮气吹干，得到基于四面体结构DNA即tsDNA的单颗粒LSPR探针，即单颗粒局域表面等离子体共振探针。

【技术特征摘要】
1.一种单颗粒生物探针的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1).分别制备金银核壳纳米立方体Au@AgNCs溶胶和四面体结构DNA溶液，并将所述Au@AgNCs固定于氧化铟锡导电膜玻璃表面；2).将所述四面体结构DNA溶液滴加到固定有Au@AgNCs的氧化铟锡导电膜玻璃表面，室温下孵育2～6h后，用超纯水洗涤，并用氮气吹干，得到基于四面体结构DNA即tsDNA的单颗粒LSPR探针，即单颗粒局域表面等离子体共振探针。2.如权利要求1所述单颗粒生物探针的构建方法，其特征在于，所述Au@AgNCs溶胶的制备方法包括如下步骤：1.1).合成纳米金种子；1.2).将所述纳米金种子与十六烷基三甲基氯化铵进行反应，得到金溶胶；1.3).将所述金溶胶与抗坏血酸在40～80℃下进行反应后，加入硝酸银，反应后得到Au@AgNCs溶胶。3.如权利要求1所述单颗粒生物探针的构建方法，其特征在于，所述Au@AgNCs固定于氧化铟锡导电膜玻璃表面的方法为：将氧化铟锡导电膜玻璃的表面清洗干净后，浸入到Au@AgNCs溶胶中，静置1～5min后取出，用超纯水清洗并用氮气吹干。4.如权利要求1所述单颗粒生物探针的构建方法，其特征在于，所述四面体结构DNA溶液的制备方法包括如下步骤：将各条单链DNA溶解，在紫外分光光度计下测定220～280nm(请给一个区间)处的吸收，并参考每条单链DNA的摩尔消光系数，确定其浓度；将四条单链DNA以等比例混合于Tris-镁盐缓冲液中，加入三(2-羧乙基)膦后，转入聚合酶链式反应仪中，在90～98℃下持续10～15min后，迅速降温至～5℃，得到tsDNA溶液。5.一种如权利要求1所述的单颗粒生物探针构建等离子体生物存储器的方法，其特征在于，包括如下步骤：利...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪联辉，张颖，帅振华，翁丽星，张磊，周浩，
申请(专利权)人：南京邮电大学，南京邮电大学南通研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32