一种单克隆抗体结合单精子冷冻载体及冷冻解冻方法技术

本发明专利技术涉及精子冷冻的技术领域，具体涉及一种单克隆抗体结合单精子冷冻载体及冷冻解冻方法。本发明专利技术首先利用APTES使玻片外表面变成羰基，而羰基非常容易和抗体蛋白表面的氨基反应，再利用某些有具有一定特质的单克隆抗体与精子表面特异性结合，抗体的粘附力将精子固定与玻片表面。本发明专利技术提供了一种可将单个或多个精子固定于载体表面的方法，可以防止精子在储存、运输、操作过程中丢失。

Monoclonal antibody combined with frozen sperm carrier and freezing thawing method

The invention relates to the technical field of sperm freezing, in particular to a monoclonal antibody combined with a single sperm carrier and a freezing thawing method. The invention first uses APTES to make the outer surface of the slide into carbonyl, and the carbonyl is very easy to react with the amino group on the surface of the antibody protein. Then some specific monoclonal antibodies are used to bind the sperm surface specifically. The adhesion force of the antibody will immobilizing the sperm and the surface of the glass. The invention provides a method for immobilizing single or multiple sperm on the surface of a carrier, preventing sperm from being lost during storage, transportation and operation.

【技术实现步骤摘要】
一种单克隆抗体结合单精子冷冻载体及冷冻解冻方法
本专利技术涉及精子冷冻的
，具体涉及一种单克隆抗体结合单精子冷冻载体及冷冻解冻方法。
技术介绍
在临床的男性不育患者中，有部分生精功能障碍的患者在取精过程中仅可获得极少量的精子，只有通过多次取精并冷冻精子才能满足患者的生育要求。冷冻的损伤会造成部分精子的损失，而现有精子冷冻技术主要针对大量精子冷冻，会造成部分精子的丢失。对于生精功能障碍而需要冷冻精子的患者来说，丢失的这部分精子则可能是致命的。因此需要开发一种不会丢失精子的冷冻技术。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种单克隆抗体结合单精子冷冻载体及冷冻解冻方法，目的是通过将单个或数个精子固定于载体表面，从而防止精子在储存、运输、操作过程中丢失，同时，保障精子的授精能力及遗传物质不会改变，操作中由于液滴分层而精子在液滴中游动造成的显微操作中寻找精子困难的问题一并得到解决。本专利技术的单克隆抗体结合单精子冷冻载体，所述的单克隆抗体具有抗原结合位点为精子表现锚定蛋白；在精子转化成熟、获能过程中不脱离精子表面；抗原抗体结合稳定，抗原抗体结合力可稳定吸附精子；精浆内无该单克隆抗体的抗原存在；单克隆抗体和精子的结合方式是单克隆抗体结合位点与该抗原决定簇特异性结合形成抗原抗体复合体，对抗原形成一定的吸附力，单克隆抗体与精子的体积比例为(10～1000)：1，形成抗体精子溶液。所述的单克隆抗体为ACRV1acrosomalvesicleprotein1[Homosapiens(human)]、PH-20[Homosapiens]；该单抗生产厂家为santcruz，货号sc5163。本专利技术的单克隆抗体结合单精子冷冻载体的冷冻解冻方法，按照以下步骤进行：(1)玻片处理：将玻片逐片加入到piranha溶液中用浸泡15-240min(最优时间15min)，然后再放入纯水中超声，至少换水三次以去除玻片表面的有机物，玻片放在80-150℃(最优温度105℃)干燥箱中干燥15-240min(最优时间30min)，备用；(2)将3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶到无水乙醇中，其质量比为1％-10％(最优比例2.5％)，将上述烘干的玻片浸到该液体中浸泡12-72小时(最优时间24小时)；此过程可以将玻片表面进行的基团-OH转换成-NH3(3)将玻片用无水乙醇冲洗1-5次(最优3次)后，浸泡在5％戊二醛水溶液中1小时，浸泡结束后用大量的超纯水冲洗；(4)将处理的玻片浸泡在浓度为0.5-0.001mg/ml(最优浓度0.1mg/ml)，温度为35℃-40℃(最优温度37℃)的精子抗体溶液中10min-24h(最优时间1小时)；(5)用显微受精针取单个或多个精子，添加在玻片表面滴加的精子冷冻保护剂中，固定5-240min(最优时间10min)；(6)将玻片装入冷冻试管中，置于液氮平面上1-10cm(最优距离2cm)；1-120min(最优时间5min)后，置于液氮内冷冻；(7)解冻：在冷冻试管中取出载体玻片，迅速插入用操作皿盛放的已经平衡至35℃-40℃(最优温度37℃)的矿物油中，一起置35℃-40℃(最优温度37℃)培养箱中复温5-240min(最优时间10min)。其中，所述的步骤(1)中玻片逐片加入到piranha溶液中用浸泡15-240min(最优时间15min)，，然后再放入纯水中超声，至少换水三次以去除玻片表面的有机物，玻片放在15-240min(最优时间15min)，干燥箱中干燥15-240min(最优时间30min)，备用。所述的步骤(2)中将3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶到无水乙醇中，其质量比为1％-10％(最优比例2.5％)，将上述烘干的玻片浸到该液体中浸泡12-72小时(最优时间24小时)小时。所述的步骤(3)中将玻片用无水乙醇冲洗1-5次(最优3次)次后，浸泡在5％戊二醛水溶液中1小时，浸泡结束后用大量的超纯水冲洗。所述的步骤(4)中将处理的玻片浸泡在浓度为为0.5-0.001mg/ml(最优浓度0.1mg/m，温度为35℃-40℃(最优温度37℃)的精子抗体溶液中10min-24h(最优时间1小时)。所述的步骤(5)中用显微受精针取单个或多个精子，添加在玻片表面滴加的精子冷冻保护剂中，固定5-240min(最优时间10min)。所述的步骤(6)中将玻片装入冷冻试管中，置于液氮平面上1-10cm(最优距离2cm)；1-120min(最优时间5min后，置于液氮内冷冻。所述的步骤(7)中在冷冻试管中取出载体玻片，迅速插入用操作皿盛放的已经平衡至35℃-40℃(最优温度37℃)的矿物油中，一起置35℃-40℃(最优温度37℃培养箱中复温5-240min(最优时间10min)。本专利技术中对固定精子质量评价的方法是：A、在显微镜下计数精子是否有丢失，丢失越少，效果越好。B、观测是否有活动精子，活动精子越多，效果越好。C、无活动精子则添加精子激活剂，观察是否有不活动精子发生抖动。D、添加五微升的低渗肿胀液，观测精子尾部是否有卷曲和膨胀，卷曲和膨胀的为活精子。与现有技术相比，本专利技术的特点是：(1)本专利技术首先利用APTES使玻片外表面变成羰基，而羰基非常容易和抗体蛋白表面的氨基反应；(2)本专利技术利用某些有具有一定特质的单克隆抗体与精子表面特异性结合，抗体的粘附力将精子固定与玻片表面；本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术可提供一种可将单个或多个精子固定于载体表面，防止精子在储存、运输、操作过程中丢失的方法；(2)本专利技术可解决操作中由于液滴分层而精子在液滴中游动造成的显微操作中寻找精子困难的问题。具体实施方式实施例1本实施例的单克隆抗体结合单精子冷冻载体，所述的单克隆抗体为ACRV1acrosomalvesicleprotein1[Homosapiens(human)]，该单抗生产厂家为santcruz，货号sc5163。单克隆抗体与精子的体积比例为(10～1000)：1，形成抗体精子溶液。本实施的单克隆抗体结合单精子冷冻载体的冷冻解冻方法，按照以下步骤进行：(1)将玻片逐片加入到piranha溶液中用浸泡15min，然后再放入纯水中超声，至少换水三次以去除玻片表面的有机物，玻片放在105℃干燥箱中干燥30min，备用；(2)将3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶到无水乙醇中，其质量比为2.5％，将上述烘干的玻片浸到该液体中浸泡24小时；(3)将玻片用无水乙醇冲洗3次后，浸泡在5％戊二醛水溶液中1小时，浸泡结束后用大量的超纯水冲洗；(4)将处理的玻片浸泡在浓度为0.1mg/ml，温度为37℃的精子抗体溶液中1小时；(5)用显微受精针取单个或多个精子，添加在玻片表面滴加的精子冷冻保护剂中，固定10min；(6)将玻片装入冷冻试管中，置于液氮平面上2cm；5min后，置于液氮内冷冻；(7)在冷冻试管中取出载体玻片，迅速插入用操作皿盛放的已经平衡至37℃的矿物油中，一起置37℃培养箱中复温10min。在显微镜下计数精子，在载体表面共找到9条精子，其中2条有尾部活动，为活精子。实施例2本实施例的单克隆抗体结合单精子冷冻载体，所述的单克隆抗体为PH-20[Homosapiens]，该单抗生产厂家为santcru本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单克隆抗体结合单精子冷冻载体，其特征在于所述的单克隆抗体具有抗原结合位点为精子表现锚定蛋白；在精子转化成熟、获能过程中不脱离精子表面；抗原抗体结合稳定，抗原抗体结合力可稳定吸附精子；精浆内无该单克隆抗体的抗原存在；单克隆抗体和精子的结合方式是单克隆抗体结合位点与该抗原决定簇特异性结合形成抗原抗体复合体，对抗原形成一定的吸附力，单克隆抗体与精子的体积比例为(10～1000)：1，形成抗体精子溶液。

【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体结合单精子冷冻载体，其特征在于所述的单克隆抗体具有抗原结合位点为精子表现锚定蛋白；在精子转化成熟、获能过程中不脱离精子表面；抗原抗体结合稳定，抗原抗体结合力可稳定吸附精子；精浆内无该单克隆抗体的抗原存在；单克隆抗体和精子的结合方式是单克隆抗体结合位点与该抗原决定簇特异性结合形成抗原抗体复合体，对抗原形成一定的吸附力，单克隆抗体与精子的体积比例为(10～1000)：1，形成抗体精子溶液。2.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体结合单精子冷冻载体，其特征在于所述的单克隆抗体为ACRV1acrosomalvesicleprotein1[Homosapiens(human)]、PH-20[Homosapiens]。3.如权利要求1所述的单克隆抗体结合单精子冷冻载体的冷冻解冻方法，其特征在于按照以下步骤进行：(1)玻片处理：将玻片逐片加入到piranha溶液中用浸泡15-240min，然后再放入纯水中超声，至少换水三次以去除玻片表面的有机物，玻片放在80-150℃干燥箱中干燥15-240min，备用；(2)将3-氨丙基三乙氧基硅烷溶到无水乙醇中，其质量比为1％-10％，将上述烘干的玻片浸到该液体中浸泡12-72小时；此过程将玻片表面进行的基团-OH转换成-NH3；(3)将玻片用无水乙醇冲洗1-5次后，浸泡在5％戊二醛水溶液中1小时，浸泡结束后用大量的超纯水冲洗；(4)将处理的玻片浸泡在浓度为0.5-0.001mg/ml，温度为35℃-40℃的精子抗体溶液中10min-24h；(5)用显微受精针取单个或多个精子，添加在玻片表面滴加的精子冷冻保护剂中，固定5-240min；(6)将玻片装入冷冻试管中，置于液氮平面上1-10cm；1-120min后，置于液氮内冷冻；(7)解冻：...

【专利技术属性】
技术研发人员：周高见，许东，汤乐，朱文兵，邢柳，
申请(专利权)人：周高见，许东，汤乐，
类型：发明
国别省市：湖南,43