一种临床检测HBV cccDNA的微滴式数字PCR方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种临床检测HBV cccDNA的微滴式数字PCR方法及试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明专利技术方法包括如下步骤：提取待测样本DNA，使用cccDNA引物对和探针(SEQ ID NO.1‑3所示)对PSAD酶消化后的DNA样本进行cccDNA定量，使用管家基因引物对和探针对未经PSAD酶消化的DNA样本进行管家基因定量标化肝细胞数目。本发明专利技术试剂盒包含用于扩增HBV cccDNA和管家基因的引物对和探针，阴性质控品和阳性质控品，ddPCR试剂和PSAD酶消化试剂。本发明专利技术检测全过程操作简单、省时，为临床患者的多种来源标本的cccDNA定量检测提供了一种新的高灵敏度方法和试剂盒。

A droplet digital PCR method and kit for clinical detection of HBV cccDNA

The invention discloses a micro drop digital PCR method and a kit for clinical detection of HBV cccDNA, and belongs to the field of biological detection technology. The method includes the following steps: extracting the sample DNA, using the cccDNA primer pair and the probe (SEQ ID NO.1 3) to quantify the DNA samples after the PSAD enzyme digestion, and using the housekeeper gene primers and the probe for the number of liver cells quantified by the housekeeping gene for the DNA samples without the PSAD enzyme digestion. The kit contains primer pairs and probes for amplification of HBV cccDNA and housekeeping genes, negative quality control products and positive quality control products, ddPCR reagents and PSAD enzyme digestion reagents. The whole process of detecting the whole process is simple and time-saving, and provides a new high sensitivity method and kit for cccDNA quantitative detection of various source specimens of clinical patients.

【技术实现步骤摘要】
一种临床检测HBVcccDNA的微滴式数字PCR方法及试剂盒
本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种用于临床检测HBVcccDNA的微滴式数字PCR方法及试剂盒。
技术介绍
全球范围内，每年都有超过75万名患者被诊断为肝细胞性肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)，其发病率在所有肿瘤中排第四位，死亡率位于第三(CHENW,ZHENGR,BAADEPD,etal.2016.CancerstatisticsinChina,2015.CACancerJClin[J],66:115-132)。60岁以下的癌症患者中，肝癌发病人数位居第二、死亡人数高居第一。在中国，每年有45万多患者被诊断为肝癌，超过40万名患者因肝癌而死亡。目前发现肝癌的主要病因有乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)的慢性感染、丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)感染、酒精以及黄曲霉素B1的暴露(FORNERA,LLOVETJM,BRUIXJ2012.Hepatocellularcarcinoma.Lancet[J],379:1245-1255.)，在中国80％以上肝癌患者均存在HBV感染。由于缺乏有效的早期诊断措施，HCC确诊时大多数患者为终末期或发生远端转移，5年生存期不到10％。目前临床肝癌的诊断主要依赖血清标志物甲胎蛋白(AFP)和医学影像学检查，血清AFP的正常参考范围为0.89～8.78ng/mL，以AFP>20ng/mL为cut-off值，诊断肝癌的灵敏度为49％～71％，特异度为49％～86％，难以实现早期诊断(OMATAM,LESMANALA,TATEISHIR,etal.2010.AsianPacificAssociationfortheStudyoftheLiverconsensusrecommendationsonhepatocellularcarcinoma.HepatolInt[J],4:439-474.)；临床上肝癌的治疗措施以手术切除为主，取得满意疗效的关键在于早期诊断。HBV属于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，正嗜肝DNA病毒属(Hepadnavirus)。HBV通常只感染肝细胞，在肝胞内复制增殖。病毒颗粒大小约为42nm，外部包膜镶嵌有3种包膜蛋白，内部为3.2kb的病毒DNA。HBV基因组是带有部分缺口的松弛环状双链DNA(relaxedcircularDNA,rcDNA)分子，含有部分单链区。HBV病毒颗粒在受体钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(sodium-taurocholatecotransportingpolypeptide，NTCP)的帮助下，进入肝细胞，rcDNA在肝细胞核内被修复闭环，形成共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA)。在宿主细胞RNA聚合酶Ⅱ的作用下，cccDNA作为转录模板形成3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb大小的4种mRNA，其中最长的3.5kbmRNA被称为前基因组RNA(pregenomicRNA，pgRNA)，这些mRNA编码相应蛋白，并组装形成HBV子代病毒(HONGX,KIMES,GUOH2017.EpigeneticRegulationofHepatitisBVirusCovalentlyClosedCircularDNA:ImplicationsforEpigeneticTherapyagainstChronicHepatitisB.Hepatology[J])。目前临床上最常用的抗HBV药物主要是核苷(酸)类似物(nucleos(t)ideanalogues,NAs)，NAs针对HBV病毒的聚合酶Poly蛋白，抑制病毒的反转录而降低HBVDNA载量，但无法清除肝细胞内cccDNA，而cccDNA的存在是HBV持续感染和复发的主要原因，在HBV介导的肝癌发生发展过程中起重要作用(GAOY,FENGJ,YANGG,etal.2017.HepatitisBvirusXprotein-elevatedMSL2modulateshepatitisBviruscovalentlyclosedcircularDNAbyinducingdegradationofAPOBEC3Btoenhancehepatocarcinogenesis.Hepatology[J],66:1413-1429.)。研究发现肝癌病人肝组织内cccDNA含量高于非肝癌病人(WONGDK,YUENMF,POONRT,etal.2006.QuantificationofhepatitisBviruscovalentlyclosedcircularDNAinpatientswithhepatocellularcarcinoma.JHepatol[J],45:553-559.)，无病生存期与肝组织内的cccDNA含量相关，cccDNA含量高的病人无病生存期显著低于cccDNA含量低的患者(HOSAKAT,SUZUKIF,KOBAYASHIM,etal.2010.HBcrAgisapredictorofpost-treatmentrecurrenceofhepatocellularcarcinomaduringantiviraltherapy.LiverInt[J],30:1461-1470.)。因此，近年来越来越多的研究致力于开发cccDNA靶向性抗病毒药物。干扰素类药物可通过多种途径来降解病毒的mRNA或阻断病毒翻译起始来控制HBV的复制，如高剂量的干扰素α通过上调肝细胞核内的APOBEC3脱氨酶降解cccDNA，并且不具有肝细胞毒性。淋巴毒素β也具有和干扰素α类似的功能，降解肝细胞内cccDNA(LUCIFORAJ,XIAY,REISINGERF,etal.2014.SpecificandnonhepatotoxicdegradationofnuclearhepatitisBviruscccDNA.Science[J],343:1221-1228.)。同时，各种siRNA、CRISPR/Cas9等靶向cccDNA的新技术也相继问世，并逐步推向临床(YANGHC,KAOJH2014.PersistenceofhepatitisBviruscovalentlyclosedcircularDNAinhepatocytes:molecularmechanismsandclinicalsignificance.EmergMicrobesInfect[J],3:e64.)。正因如此，临床上迫切需要新方法针对cccDNA评价这些新药物的抗HBV治疗效果。cccDNA在体内的含量很低：在慢性HBV感染的鸭肝内cccDNA大约是10copies/cell(ZHANGYY,ZHANGBH,THEELED,etal.2003.Single-cellanalysisofcovalentlyclosedcircularDNAcopynumbersinahepadnavirus-infectedliver.ProcNatlAcadSciUSA[J],100:123本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HBV cccDNA定量检测ddPCR试剂盒，其特征在于：包含用于扩增HBV cccDNA的cccDNA引物对和探针，以及用于扩增管家基因的引物对和探针；其中，用于扩增HBV cccDNA的cccDNA引物对和探针为：cccDNA‑F：5’‑TTCTCCGTCTGCCGTTCC‑3’，cccDNA‑R：5’‑CACAGCTTGGAGGCTTGA‑3’，cccDNA‑probe：5’‑荧光基团‑CACCAAATATTGCCCAAGGT‑淬灭基团‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种HBVcccDNA定量检测ddPCR试剂盒，其特征在于：包含用于扩增HBVcccDNA的cccDNA引物对和探针，以及用于扩增管家基因的引物对和探针；其中，用于扩增HBVcccDNA的cccDNA引物对和探针为：cccDNA-F：5’-TTCTCCGTCTGCCGTTCC-3’，cccDNA-R：5’-CACAGCTTGGAGGCTTGA-3’，cccDNA-probe：5’-荧光基团-CACCAAATATTGCCCAAGGT-淬灭基团-3’。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的管家基因为β-actin基因，用于扩增β-actin基因的引物对和探针为：β-actin-F：5’-CCTCGCTGTCCACCTTCCA-3’，β-actin-R：5’-TCACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3’，β-actin-probe：5’-荧光基团-AGATGAGATTGGCATGGCTTT-淬灭基团-3’。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：包含阴性质控品和阳性质控品。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述的阴性质控品为pMD18-T空载质粒，所述的阳性质控品为插入有cccDNA片段的pMD18-T阳性质粒。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：包含ddPCR试剂和PSAD酶消化试剂。6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：提取待测样本DNA；PSAD酶对待测样本DNA进行消化；配制ddPCR反应体系；制备油包水微滴；对微滴进行P...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘松梅，黄景涛，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42