一种水稻镉积累相关基因OsHMA3的基因内分子标记Caps7及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，提供了一种水稻镉积累相关基因OsHMA3的基因内分子标记Caps7及其应用，通过设计合成了正反两条引物，在PCR体系中对水稻DNA进行扩增，然后对扩增产物进行酶切，最后通过琼脂糖电泳检测确定待测水稻含有HMA3‑1或HMA3‑2等位基因，从而确定水稻镉积累性状并辅助籼稻低镉积累品种的选育。本发明专利技术可以有效的鉴别水稻镉积累性状，并为籼稻镉低积累品种的选育提供新的技术手段，提高选育效率。

An intramolecular molecular marker Caps7 for rice cadmium accumulation related gene OsHMA3 and its application

The invention belongs to the field of molecular biology technology, provides an intramolecular molecular marker Caps7 for rice cadmium accumulation related gene OsHMA3 and its application. By designing and synthesizing two positive and negative primers, the rice DNA is amplified in the PCR system, and then the amplified product is cut by enzyme. Finally, the agarose electrophoresis is used to determine the pending. The HMA3 allele 1 or HMA3 2 allele was detected in rice, so as to determine the cadmium accumulation characteristics of rice and to assist the breeding of low cadmium accumulation varieties in indica rice. The invention can effectively identify the cadmium accumulation characteristics of rice, and provide new technical means for the breeding of low cadmium accumulation varieties of indica rice, so as to improve the breeding efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种水稻镉积累相关基因OsHMA3的基因内分子标记Caps7及其应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种水稻镉积累相关基因OsHMA3的基因内分子标记Caps7及其应用。
技术介绍
稻田镉(Cadmium，Cd)污染导致的稻米镉超标，严重影响我国的食品安全和粮食安全。因此，为了避免镉污染对人体的伤害，急需降低水稻籽粒中积累的镉。对于水稻品种稻米镉积累的遗传特征研究发现，籼稻品种往往比粳稻品种在籽粒中积累更多的镉。而在我国南方稻米主产区，单一的籼稻种植结构，偏酸性的土壤背景和较高的镉污染程度，加重了籼稻品种稻米镉含量超标的风险。那么，在彻底根治稻田镉污染之前，种植稻米镉低积累的籼稻品种是目前避免镉污染风险最经济有效的方法。但是由于稻米镉积累性状不能被育种家在实际的品种选育过程中直接观察，因此低镉水稻品种的选育需要鉴别、利用优异的基因资源及相对应的分子辅助手段(MarkerAssistedSelection,MAS)。能有效鉴别水稻镉积累性状的分子辅助手段仍处于待开发阶段。
技术实现思路
针对以上技术问题，本专利技术提供了一种水稻镉积累相关基因OsHMA3的基因内分子标记Caps7及其应用，可以有效的鉴别水稻品种镉积累性状并加快籼稻低镉积累品种的选育过程。目前，对于水稻籽粒镉积累性状，科研人员已经鉴定出一系列控制水稻镉吸收、转运及分配的关键数量性状位点及相关基因，其中位于水稻第七号染色体短臂处的一个控制影响水稻镉转运率的主效QTL已经被分离克隆，命名为OsHMA3(Uenoetal，2010)。该基因主要通过控制影响水稻根系液泡对根系吸收的镉进行隔离，减少了向地上部位转运的镉，从而影响水稻镉转运率。专利技术人利用连锁分析及关联分析对稻米镉积累进行研究，发现基因OsHMA3能影响水稻从土壤吸收的镉在稻米中的积累；同时发现该基因在自然群体内主要存在两种重要的等位基因型HMA3-1和HMA3-2，HMA3-2核苷酸序列见SEQIDNO:1所示，这两种等位基因型占自然群体内的85％以上，含有HMA3-1的水稻品种的稻米镉含量显著低于含有HMA3-2的水稻品种(P<0.01)；专利技术人进一步分析发现HMA3-1和HMA3-2存在明显的籼-粳分化的特征，即粳稻品种往往含有HMA3-1，而籼稻品种则大部分含有HMA3-2而少部分含有HMA3-1。本专利技术的遗传学背景的重点在于：1)大部分籼稻品种的稻米镉含量往往处于一个较高的水平(相同相似的土壤环境下，籼稻往往积累更多)，这一原因很可能是由于OsHMA3的等位基因型为高镉积累基因型HMA3-2；2)通过分子辅助手段可以将镉低积累等位基因型HMA3-1导入高积累品种(替换OsHMA3的高积累等位基因型HMA3-2)，为改良籼稻品种的镉积累特征提供重要的遗传学手段及相关品种、品系。本专利技术的技术方案为：提供了一种水稻镉积累相关基因OsHMA3的基因内分子标记Caps7，基因OsHMA3包含等位基因HMA3-1和等位基因HMA3-2，所述分子标记Caps7能区分等位基因HMA3-1和等位基因HMA3-2的序列差异。进一步的，所述分子标记Caps7的PCR扩增引物对为：正向引物F(SEQIDNO:4)：CTCGTCAGCGGCCTCAAGG；反向引物R(SEQIDNO:5)：GCACGACGAGGAGGCACG；所述分子标记Caps7表现为：利用所述引物对进行PCR扩增时，等位基因HMA3-1的扩增产物具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列，等位基因HMA3-2的扩增产物具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列；所述等位基因HMA3-1表现为低镉积累，所述等位基因HMA3-2的核苷酸序列为SEQIDNO:1所示，表现为高镉积累。本专利技术还提供一种利用上述分子标记Caps7区分等位基因HMA3-1和HMA3-2的方法，利用前面所述引物对对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增；对PCR产物用AscI内切酶酶切，琼脂糖电泳检测酶切后的扩增产物，若琼脂糖电泳检测显示为一条条带，则待测水稻具有等位基因HMA3-1；若琼脂糖电泳检测显示为两条条带，则待测水稻具有等位基因HMA3-2，若琼脂糖电泳检测显示为三条条带，则待测水稻的基因OsHMA3为杂合状态。进一步的，若琼脂糖电泳检测显示为一条条带，序列长度为337bp，则待测水稻具有等位基因HMA3-1，表现为低镉积累；若琼脂糖电泳检测显示为两条条带，序列长度分别为196bp、141bp，则待测水稻具有等位基因HMA3-2，表现为高镉积累，若琼脂糖电泳检测显示为三条条带，序列长度分别为337bp、196bp和141bp，且序列长度为337bp的条带最亮，则待测水稻的基因OsHMA3为杂合状态。进一步的，所述PCR体系为：模板DNA10～50ng，正向引物和反向引物各0.25um，TaqDNA聚合酶1U，四种脱氧核糖核苷酸dATP、dTTP、dCTP、dGTP各0.1mM，2×GCbufferI10ul，其余部分用去离子水补齐至20ul；所述PCR反应程序为：首先在94℃预变性4min，之后进入PCR循环扩增，循环扩增包括94℃变性30sec，60℃或62℃退火30sec，72℃延伸1min，共三步，循环运行30～34次，最后在72℃延伸10min后，25℃保温4min得到扩增产物；所述酶切体系为10ul体系，将以下各组分混合：PCR扩增产物100～200ng，AscI内切酶Buffer(10X)1ul，AscI内切酶2U，其余用去离子水补齐；酶切程序：将混合好的酶切体系放置于37℃恒温箱中反应8～12h以上进行酶切。本专利技术还提供了前面所述分子标记Caps7及其PCR扩增引物对在鉴定水稻镉积累性状中的用途。本专利技术还提供了前面所述分子标记Caps7及其PCR扩增引物对在低镉积累籼稻品种选育中的用途。本专利技术还提供了前面所述区分等位基因HMA3-1和HMA3-2的方法在低镉积累籼稻品种选育中的用途。本专利技术还提供了一种鉴定水稻镉积累性状的方法，利用前面所述的引物对对待测水稻的基因组DNA进行分子标记Caps7的PCR扩增，并用AscI内切酶酶切，琼脂糖电泳检测PCR产物的长度，确定水稻镉积累性状；若琼脂糖电泳检测显示为一条条带，序列长度为337bp，则待测水稻具有等位基因HMA3-1，表现为低镉积累；若琼脂糖电泳检测显示为两条条带，序列长度分别为196bp、141bp，则待测水稻具有等位基因HMA3-2，表现为高镉积累，若琼脂糖电泳检测显示为三条条带，序列长度分别为337bp、196bp和141bp，且序列长度为337bp的条带最亮，则待测水稻的基因OsHMA3为杂合状态。本专利技术还提供了一种低镉积累籼稻辅助育种方法，所述方法包括：通过前面所述的方法，检测分子标记Caps7，以确定待测籼稻镉积累性状。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1、本专利技术通过对控制影响稻米镉积累的主效QTL基因OsHMA3的自然变异研究，开发出一个能有效区分低镉积累等位基因型HMA3-1和高镉积累等位基因型HMA3-2的基因内分子标记Caps7。2、本专利技术的基因内分子标记Caps7可以有效的鉴别水稻为镉积累性状，并为选育低镉积累籼稻品种提供新的技术手段，加快了选育过程。3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水稻镉积累相关基因OsHMA3的基因内分子标记Caps7，其特征在于：基因OsHMA3包含等位基因HMA3‑1和等位基因HMA3‑2，所述分子标记Caps7能区分等位基因HMA3‑1和等位基因HMA3‑2的序列差异。

【技术特征摘要】
1.一种水稻镉积累相关基因OsHMA3的基因内分子标记Caps7，其特征在于：基因OsHMA3包含等位基因HMA3-1和等位基因HMA3-2，所述分子标记Caps7能区分等位基因HMA3-1和等位基因HMA3-2的序列差异。2.根据权利要求1所述的分子标记Caps7，其特征在于，所述分子标记Caps7的PCR扩增引物对为：正向引物F(SEQIDNO:4)：CTCGTCAGCGGCCTCAAGG；反向引物R(SEQIDNO:5)：GCACGACGAGGAGGCACG；所述分子标记Caps7表现为：利用所述引物对进行PCR扩增时，等位基因HMA3-1的扩增产物具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列，等位基因HMA3-2的扩增产物具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列；所述等位基因HMA3-1表现为低镉积累，所述等位基因HMA3-2的核苷酸序列为SEQIDNO:1所示，表现为高镉积累。3.一种利用权利要求2所述的分子标记Caps7区分等位基因HMA3-1和HMA3-2的方法，其特征在于：利用权利要求2所述引物对对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物用AscI内切酶酶切，琼脂糖电泳检测酶切后的扩增产物，若琼脂糖电泳检测显示为一条条带，则待测水稻具有等位基因HMA3-1；若琼脂糖电泳检测显示为两条条带，则待测水稻具有等位基因HMA3-2，若琼脂糖电泳检测显示为三条条带，则待测水稻的基因OsHMA3为杂合状态。4.根据权利要求3所述的区分等位基因HMA3-1和HMA3-2的方法，其特征在于：若琼脂糖电泳检测显示为一条条带，序列长度为337bp，则待测水稻具有等位基因HMA3-1，表现为低镉积累；若琼脂糖电泳检测显示为两条条带，序列长度分别为196bp、141bp，则待测水稻具有等位基因HMA3-2，表现为高镉积累，若琼脂糖电泳检测显示为三条条带，序列长度分别为337bp、196bp和141bp，且序列长度为337bp的条带最亮，则待测水稻的基因OsHMA3为杂合状态。5.根据权利要求3所述的区分等位基因HMA3-1和HMA3-2的方法，其特征在于，所述PCR体系为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙亮，陈彩艳，
申请(专利权)人：中国科学院亚热带农业生态研究所，
类型：发明
国别省市：湖南,43