一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术属生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，尤其是克隆和原核表达泛素化修饰系统的E1，E2与泛素分子，以及应用于人源蛋白体外泛素化修饰验证。本发明专利技术中使用大肠杆菌原核表达并纯化泛素化E1酶Uba1，E2酶Ubc5a和泛素分子GST‑ubiquitin，在合适的反应缓冲液、时间、温度和蛋白浓度配比下，可以对特定的泛素E3连接酶或是蛋白底物进行体外泛素化修饰。该试剂盒可以方便、准确地鉴定底物蛋白是否具有泛素化修饰，能被广范围应用于泛素化验证实验。

A rapid detection kit for ubiquitin protein modification in vitro

The invention belongs to the field of Biochemistry and molecular biology, and specifically relates to a rapid detection kit for ubiquitination of protein in vitro, especially E1, E2 and ubiquitin molecule in the cloning and prokaryotic expression of ubiquitination modification system, and the application of ubiquitination in human protein in vitro. In the present invention, the Escherichia coli prokaryotic expression and purification of ubiquitination E1 enzyme Uba1, E2 enzyme Ubc5a and ubiquitin GST ubiquitin are used to modify the specific ubiquitin E3 ligase or protein substrate in vitro with appropriate reaction buffer, time, temperature and protein concentration. The kit can conveniently and accurately identify whether ubiquitin modification of substrate proteins can be widely used in ubiquitination verification experiments.

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒
本专利技术属生物化学与分子生物学领域，涉及基因的开发与应用，具体涉及一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，尤其是克隆和原核表达泛素化修饰系统的E1，E2与泛素分子，以及应用于人源蛋白体外泛素化修饰验证。
技术介绍
现有技术公开了泛素分子为存在于真核细胞中的一类小分子保守蛋白，由76个氨基酸组成，分子量约8.5kDa；泛素分子依次经过E1激活酶，E2结合酶和E3连接酶作用之后，其C末端甘氨酸可与底物蛋白上的赖氨酸共价链接，从而实现泛素化修饰。泛素化修饰是细胞内重要的蛋白翻译后修饰之一，在细胞内参与多项生理过程调节，如DNA损伤修复、细胞周期调节、蛋白酶体降解等，其中泛素化-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasomesystem,UPS)为细胞内最主要的一条蛋白质降解途径，其功能异常可诱发神经退行性疾病，癌症，免疫紊乱以及细菌、病毒感染等人类疾病。因此研究蛋白质的泛素化具有重要的意义，而鉴定泛素化修饰是泛素相关研究中最重要的内容之一。基于现有技术的研究现状，本申请的专利技术人拟提供一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，尤其是克隆和原核表达泛素化修饰系统的E1，E2与泛素分子，以及应用于人源蛋白体外泛素化修饰验证。
技术实现思路
本专利技术的目的在于基于现有技术的现状，提供一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，尤其涉及克隆和原核表达泛素化修饰系统的E1，E2与泛素分子，以及应用于人源蛋白体外泛素化修饰验证。本专利技术提供的一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，其包括，克隆和原核表达泛素化修饰系统的E1，E2与泛素分子以及反应缓冲液配方和蛋白体系配方。本专利技术中，克隆人源泛素化E1激活酶Uba1全长cDNA序列至pET-23b原核表达载体，并在其N端和C端分别加上用于纯化和检测的Myc和His蛋白标签核酸序列。本专利技术中，利用泛素化E1激活酶Uba1重组原核表达载体，在E.coliBL21(DE3)中成功表达并利用His标签纯化Uba1蛋白。本专利技术中，克隆人源泛素化E2激活酶Ubc5a全长cDNA序列至pRSETB原核表达载体，并在其N端和C端分别加上用于纯化和检测的His和Flag蛋白标签核酸序列。本专利技术中，利用泛素化E1激活酶Ubc5a重组原核表达载体，在E.coliBL21(DE3)中成功表达并利用His标签纯化Ubc5a蛋白。本专利技术中，克隆人源泛素化蛋白全长cDNA序列至pGEX-4T-2原核表达载体，并在其N端和C端分别加上用于纯化和检测的GST蛋白标签核酸序列。本专利技术中，利用泛素化蛋白重组原核表达载体，在E.coliBL21(DE3)中成功表达并利用GST标签纯化泛素蛋白。本专利技术的实施例中，公开了一种编码蛋白为人源泛素化E1蛋白酶Uba1的氨基酸序列，所述序列cDNA片段长为3174bp,编码1058个氨基酸，分子量为117849Da的蛋白，序列如SEQIDNo:1所示的氨基酸序列；所述的氨基酸序列，还包括SEQIDNo:1的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列；以及公开了一种核苷酸序列，该核酸序列编码所述的蛋白质。本专利技术的实施例中，公开了一种编码蛋白为人源泛素化E2蛋白酶Ubc5a的氨基酸序列，该序列cDNA片段长为441bp,编码147个氨基酸，分子量为16602Da的蛋白，序列如SEQIDNo:2所示的氨基酸序列；所述的氨基酸序列还包括SEQIDNo:2的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列；以及公开了一种核苷酸序列，该核酸序列编码所述的蛋白质。本专利技术的实施例中，公开了一种编码蛋白为人源泛素化蛋白的氨基酸序列，该序列cDNA片段长为228bp,编码76个氨基酸，分子量为8565Da的蛋白，序列如SEQIDNo:3所示的氨基酸序列；所述的氨基酸序列还包括SEQIDNo:3的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列；以及公开了一种核苷酸序列，该核酸序列编码所述的蛋白质。本专利技术研究并确立了蛋白体外泛素化修饰的反应缓冲液条件：50mMTris,pH7.5,5mMMgCl2,200mMNaCl,5mMATP本专利技术研究并确立了蛋白体外泛素化修饰的反应温度和时间：30-37℃区间范围内的水温，水浴0.5-3小时本专利技术研究并确立了蛋白体外泛素化修饰的蛋白酶浓度配比：20μl总的反应体系，其中Uba1蛋白的浓度在21-340nM浓度区间范围内，Ubc5a蛋白的浓度在0.375-6μM浓度区间范围内，泛素分子蛋白浓度在1-25μM浓度区间范围内。本专利技术研究并确立了使用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色法和Westernblot法检测蛋白体外泛素化修饰。本专利技术提供了一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，其包括克隆和原核表达泛素化修饰系统的E1，E2与泛素分子以及反应缓冲液配方和蛋白体系配方。本专利技术中使用大肠杆菌原核表达并纯化泛素化E1酶Uba1，E2酶Ubc5a和泛素分子GST-ubiquitin，在合适的反应缓冲液、时间、温度和蛋白浓度配比下，可以对特定的泛素E3连接酶或是蛋白底物进行体外泛素化修饰。所述试剂盒可以方便、准确地鉴定底物蛋白是否具有泛素化修饰，能被广范围应用于泛素化验证实验。为便于理解，以下将通过具体的附图和具体实施方式对本专利技术进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实施方式和附图仅是为了说明，显示本领域的技术人员可以根据本文说明，在本专利技术的范围内对本专利技术做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本专利技术的范围内。附图说明图1示出人源泛素化E1蛋白Uba1氨基酸序列(即SEQIDNO：1)，人源泛素化E2蛋白Ubc5a氨基酸序列(即SEQIDNO：2)，人源泛素蛋白氨基酸序列(即SEQIDNO：3)。图2示出人源泛素化E1蛋白Uba1经原核表达纯化之后的蛋白条带，使用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色，结果经仪器扫描后调为黑白色，星号(*)标记的蛋白条带为Uba1。图3示出人源泛素化E2蛋白Ubc5a经原核表达纯化之后的蛋白条带。使用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色，结果经仪器扫描后调为黑白色，星号(*)标记的蛋白条带为Ubc5a。图4示出人源泛素蛋白GST-ubiquitin经原核表达纯化之后的蛋白条带。使用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色，结果经仪器扫描后调为黑白色，星号(*)标记的蛋白条带为GST-ubiquitin。图5示出SDS-PAGE考马斯亮蓝染色法检测蛋白体外泛素化修饰结果。使用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色，结果经仪器扫描后调为黑白色，星号(*)标记的蛋白条带为多聚GST-ubiquitin修饰条带。图6示出westernblot(anti-GST抗体)检测蛋白体外泛素化修饰结果。红色线条标示的范围为多聚GST-ubiquitin修饰条带。具体实施方案实施例11、基因Uba1,Ubc5a和GST-ubiquitin表达载体的构建以人源细胞的cDNA为模板，设计引物分别PCR扩展基因片段Uba1,Ubc5a和ubiquitin，经BamHI和EcoRI酶切后，分别连入对应的原核表达载体pET-23b(已带有Myc和His标签)，pRSETB(已带有His和Flag标签)和pGEX-4T-2(已带有G本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，其特征在于，其包括，克隆和原核表达泛素化修饰系统的E1，E2与泛素分子以及反应缓冲液配方和蛋白体系配方。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，其特征在于，其包括，克隆和原核表达泛素化修饰系统的E1，E2与泛素分子以及反应缓冲液配方和蛋白体系配方。2.一种编码蛋白为人源泛素化E1蛋白酶Uba1的氨基酸序列，其特征在于：该序列cDNA片段长为3174bp,编码1058个氨基酸，分子量为117849Da的蛋白，序列如SEQIDNo:1所示的氨基酸序列。3.一种核苷酸序列，其特征在于，该核酸序列编码权利要求2所述的蛋白质。4.按权利要求2所述的氨基酸序列，其特征在于，它还包括SEQIDNo:1的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列。5.一种编码蛋白为人源泛素化E2蛋白酶Ubc5a的氨基酸序列，其特征在于：该序列cDNA片段长为441bp,编码147个氨基酸，分子量为16602Da的蛋白，序列如SEQIDNo:2所示的氨基酸序列。6.一种核苷酸序列，其特征在于，该核酸序列编码权利要求5所述的蛋白质。7.按权利要求5所述的氨基酸序列，其特征在于，它还包括SEQIDNo:2的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列。8.一种编码蛋白为人源泛素化蛋白的氨基酸序列，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡启良，干劲，朱彩霞，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31