本发明专利技术属生物化学与分子生物学领域，涉及蛋白体外SUMO化修饰快速检测试剂盒，尤其涉及克隆和原核表达SUMO化修饰系统的E1，E2，E3以及SUMO‑1和SUMO‑2分子，以及应用于人源蛋白体外SUMO化修饰验证。本发明专利技术中使用大肠杆菌原核表达并纯化SUMO化E1酶AOS‑Uba1，E2酶Ubc9，E3酶KAP1以及SUMO‑1和SUMO‑2分子，在合适的反应缓冲液、时间、温度和蛋白浓度配比下，对特定的SUMO E3连接酶或是蛋白底物进行体外SUMO化修饰。该试剂盒可以方便、准确地鉴定底物蛋白是否具有SUMO化修饰，能被广范围应用于SUMO化修饰验证实验。
A rapid detection kit for protein SUMO modification in vitro
The invention belongs to the field of Biochemistry and molecular biology, and involves the rapid detection kit for protein SUMO modification in vitro, especially the E1, E2, E3 and SUMO 1 and SUMO 2 molecules of the cloning and prokaryotic expression SUMO modification system, as well as the application of the SUMO modification of human protein in vitro. The present invention uses the Escherichia coli to express and purify the SUMO E1 enzyme AOS Uba1, E2 enzyme Ubc9, E3 enzyme KAP1, and SUMO 1 and SUMO 2 molecules, and modify the specific SUMO E3 ligase or protein substrate in the appropriate reaction buffer, time, temperature and protein concentration. The kit can conveniently and accurately identify whether the substrate protein has SUMO modification and can be widely used in SUMO modification verification experiments.
【技术实现步骤摘要】
一种蛋白体外SUMO化修饰快速检测试剂盒
本专利技术属生物化学与分子生物学领域，涉及蛋白体外SUMO化修饰快速检测试剂盒，尤其涉及克隆和原核表达SUMO化修饰系统的E1，E2，E3以及SUMO-1和SUMO-2分子，以及应用于人源蛋白体外SUMO化修饰验证。
技术介绍
现有技术公开了小泛素相关修饰物(smallubiquitin-likemodifier,SUMO)具有与泛素分子相近的分子量和相似修饰循环，被称为小分子泛素样修饰蛋白。研究显示，在哺乳类动物细胞中共有四类SUMO同种型(isoform),分别为SUMO-1,-2,-3和-4，其中，SUMO-1只能形成单SUMO修饰；SUMO-2和SUMO-3高度同源，序列一致性高达97％，可以形成多聚SUMO修饰，而SUMO-4具有组织特异性，且功能尚不清楚。有研究显示，SUMO分子经SENP酶切割活化后，依次经过E1激活酶，E2结合酶和E3连接酶作用，其C末端甘氨酸可与底物蛋白上的赖氨酸共价链接，从而实现SUMO化修饰，其中SUMO化E1激活酶由两个蛋白组成复合物共同协作；SUMO修饰主要存在于细胞核内，可影响酶活性，改变蛋白亚细胞定位，或是作为促进蛋白相互作用的信号，参与大型蛋白复合物的组装，最终广泛参与了基因转录的抑制与激活，DNA复制与修复，染色体重组与分离等过程；因此研究蛋白质的SUMO化具有重要的意义，而鉴定蛋白SUMO化修饰是SUMO相关研究中最重要的内容之一。基于现有技术研究的现状，本申请的专利技术人拟提供一种蛋白体外SUMO化修饰快速检测试剂盒，进一步应用于人源蛋白体外SUMO化修饰验证。
技术实现思路
本专利技术的目的在于基于现有技术研究的现状，提供蛋白体外SUMO化修饰快速检测试剂盒，尤其涉及克隆和原核表达SUMO化修饰系统的E1，E2，E3以及SUMO-1和SUMO-2分子，进一步应用于人源蛋白体外SUMO化修饰验证。更具体的，本专利技术提供了蛋白体外SUMO化修饰快速检测试剂盒，其包括，克隆和原核表达SUMO化修饰系统的E1，E2，E3以及SUMO-1和SUMO-2分子。本专利技术中的试剂盒应用于人源蛋白体外SUMO化修饰验证，其包括；克隆人源SUMO化E1激活酶AOS1和Uba2基因,其中AOS1全长cDNA序列克隆至pET-28a原核表达载体，在其N端有用于纯化和检测His蛋白标签核酸序列；Uba2全长cDNA序列克隆至pET-11d；本专利技术所述的编码蛋白为人源SUMO化E1蛋白酶AOS1和Uba2的氨基酸序列，所述序列AOS1蛋白的cDNA片段长为1038bp,编码346个氨基酸，分子量为38450Da的蛋白，序列如SEQIDNo:1所示的氨基酸序列；所述序列Uba2蛋白的cDNA片段长为1920bp,编码640个氨基酸，分子量为71224Da的蛋白，序列如SEQIDNo:2所示的氨基酸序列；所述的氨基酸序列，还包括SEQIDNo:1和SEQIDNo:2的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列；本专利技术提供了一种核苷酸序列，该核酸序列编码上述的蛋白质；本专利技术中，分别利用所述的AOS1和Uba2重组原核表达载体，在E.coliBL21(DE3)中成功表达出重组蛋白，两个蛋白在缓冲液中互作结合之后，利用His标签纯化AOS1-Uba2蛋白；本专利技术中，克隆人源SUMO化E2结合酶Ubc9全长cDNA序列至pET-15b原核表达载体，在其N端有用于纯化和检测的His蛋白标签核酸序列；本专利技术提供了编码蛋白为人源SUMO化E2蛋白酶Ubc9的氨基酸序列：该序列cDNA片段长为441bp,编码147个氨基酸，分子量为16602Da的蛋白，序列如SEQIDNo:3所示的氨基酸序列；所述的氨基酸序列还包括SEQIDNo:3的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列；本专利技术提供了编码上述的蛋白质的核苷酸序列；本专利技术中，利用SUMO化E1激活酶Ubc9重组原核表达载体，在E.coliBL21(DE3)中成功表达并利用His标签纯化Ubc9蛋白；本专利技术中，克隆人源SUMO化E3连接酶KAP1全长cDNA序列至pET-28a原核表达载体，在其N端有用于纯化和检测的His蛋白标签核酸序列；所述的编码蛋白为人源SUMO化E3蛋白酶KAP1的氨基酸序列，其序列cDNA片段长为2505bp,编码835个氨基酸，分子量为88550Da的蛋白，序列如SEQIDNo:4所示的氨基酸序列；所述的氨基酸序列还包括SEQIDNo:4的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列；本专利技术号提供了编码上述的蛋白质的核苷酸序列；本专利技术中，利用SUMO化E3连接酶KAP1重组原核表达载体，在E.coliBL21(DE3)中成功表达并利用His标签纯化KAP1蛋白；本专利技术中，克隆人源SUMO-1全长cDNA序列至pET-15b原核表达载体，在其N端有用于纯化和检测的His蛋白标签核酸序列；本专利技术中，利用SUMO-1重组原核表达载体，在E.coliBL21(DE3)中成功表达并利用His标签纯化SUMO1蛋白；本专利技术提供了编码蛋白为人源SUMO-1的氨基酸序列，该序列cDNA片段长为291bp,编码97个氨基酸，分子量11133Da的蛋白，序列如SEQIDNo:5所示的氨基酸序列；所述的氨基酸序列还包括SEQIDNo:5的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列；以及提供了编码所述的蛋白质的核苷酸序列；本专利技术提供了编码蛋白为人源SUMO-2的氨基酸序列，该序列cDNA片段长为279bp,编码93个氨基酸，分子量10610Da的蛋白，序列如SEQIDNo:6所示的氨基酸序列；所述的氨基酸序列，还包括SEQIDNo:6的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列；以及提供了编码所述的蛋白质的核苷酸序列。本专利技术中，克隆人源SUMO-2全长cDNA序列至pET-15b原核表达载体，在其N端有用于纯化和检测的His蛋白标签核酸序列；本专利技术中，利用SUMO-2重组原核表达载体，在E.coliBL21(DE3)中成功表达并利用His标签纯化SUMO2蛋白。本专利技术中研究并确立了蛋白体外SUMO化修饰的反应缓冲液条件为：50mMTris,pH7.5,5mMMgCl2,2mMATP；以及，确立了蛋白体外SUMO化修饰的反应温度和时间为：30-37℃区间范围内的水温，水浴0.5-3小时；以及，确立了蛋白体外SUMO化修饰的蛋白酶浓度配比为：20μl总的反应体系，其中AOS1-Uba2蛋白的浓度在50-400nM浓度区间范围内，Ubc9蛋白的浓度在1-3μM浓度区间范围内，KAP1蛋白的浓度在0.1-1μM浓度区间范围内，SUMO-1/2分子蛋白浓度在1-20μM浓度区间范围内；本专利技术中，使用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色法和Westernblot法检测蛋白体外SUMO化修饰。本专利技术提供了一种应用于人源蛋白体外SUMO化修饰验证的检测试剂盒，使用大肠杆菌原核表达并纯化SUMO化E1酶AOS-Uba1，E2酶Ubc9，E3酶KAP1以及SUMO-1和SUMO-2分子，在合适的反应缓冲液、时间、温度和蛋白浓度配比下，可以对特定的SUMOE3连本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种蛋白体外SUMO化修饰快速检测试剂盒，其特征在于，其包括，克隆和原核表达SUMO化修饰系统的E1，E2，E3以及SUMO‑1和SUMO‑2分子；以及，反应缓冲液和蛋白体系配方。
【技术特征摘要】
1.一种蛋白体外SUMO化修饰快速检测试剂盒，其特征在于，其包括，克隆和原核表达SUMO化修饰系统的E1，E2，E3以及SUMO-1和SUMO-2分子；以及，反应缓冲液和蛋白体系配方。2.一种编码蛋白为人源SUMO化E1蛋白酶AOS1和Uba2的氨基酸序列，其特征在于：1)序列AOS1蛋白的cDNA片段长为1038bp,编码346个氨基酸，分子量为38450Da的蛋白，序列如SEQIDNo:1所示的氨基酸序列；2)序列Uba2蛋白的cDNA片段长为1920bp,编码640个氨基酸，分子量为71224Da的蛋白，序列如SEQIDNo:2所示的氨基酸序列。3.一种核苷酸序列，其特征在于，该核酸序列编码权利要求2所述的蛋白质。4.按权利要求1所述的氨基酸序列，其特征在于，它还包括SEQIDNo:1和SEQIDNo:2的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列。5.一种编码蛋白为人源SUMO化E2蛋白酶Ubc9的氨基酸序列，其特征在于：该序列cDNA片段长为441bp,编码147个氨基酸，分子量为16602Da的蛋白，序列图SEQIDNo:3所示的氨基酸序列。6.一种核苷酸序列，其特征在于，该核酸序列编码权利要求5所述的蛋白质。7.按权利要求5所述的氨基酸序列，其特征在于，它还包括SEQIDNo:3的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列。8.一种编码蛋白为人源SUMO化E3蛋白酶KAP1的氨基酸序列，其特征在于：该序列cDNA片段长为2505bp,编码835个氨基酸，分子量为88550Da的蛋白，序列如SEQIDNo:4所示的氨基酸序列。9.一种核苷酸序列，其特征在于，该核酸序列编码权利要求8所述的蛋白质。10.按权利要求8所述的氨基酸序列，其特征在于，它还包括SE...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡启良，干劲，朱彩霞，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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