一种卢立康唑中间体的酶法制备方法技术

技术编号:18455668 阅读:22 留言:0更新日期:2018-07-18 11:31
一种卢立康唑中间体的酶法制备方法,所述方法以2‑氯‑1‑(2,4‑二氯苯基)乙酮为底物,在酮还原酶、辅因子及氢供体的存在下,发生不对称还原反应生成(S)‑2‑氯‑1‑(2,4‑二氯苯基)乙醇,包括如下步骤:(1)酮还原酶的制备:将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含有卡那霉素抗性的液体LB培养基中,37℃过夜培养;将活化后得到的培养物接种到含有卡那霉素的液体LB培养基中,37℃振荡培养至OD600为0.6‑0.8,加入终浓度为0.1M的IPTG,于25℃下诱导培养8‑10h;离心,收集菌体,超声破壁后即获得重组酮还原酶;(2)(S)‑2‑氯‑1‑(2,4‑二氯苯基)乙醇的制备:将底物2‑氯‑1‑(2,4‑二氯苯基)乙酮加入到缓冲液中并加入一定量的辅因子NAD(P)及异丙醇,加入重组酮还原酶于30℃进行生物催化反应,待反应结束后,加入乙酸乙酯进行萃取,即获得产物(S)‑2‑氯‑1‑(2,4‑二氯苯基)乙醇。

An enzymatic preparation method for the intermediate of lulinazol

An enzymatic preparation method for the intermediates of luimazopazole, with the method of asymmetric reduction reaction (S) in the presence of ketone reductase, cofactor and hydrogen donor in the presence of ketone reductase, cofactor and hydrogen donor in the presence of 2 chlorophenol (2,4 two chlorophenyl) acetone, including the following steps: preparation of (1) ketone reductase The recombinant Escherichia coli containing the ketone reductase gene was inoculated into the liquid LB medium containing kanamycin resistance, at 37 C for overnight culture, and the activated culture was inoculated into the liquid LB medium containing kanamycin, 37 C was cultured to 0.6 OD600 0.8, and the final concentration was 0.1M IPTG, and 25 8 10h was induced and cultured at centigrade; the recombinant ketone reductase was obtained after centrifugation, and the preparation of recombinant ketone reductase was obtained after ultrasonic wall breaking. (2) the preparation of (S) 2 chloride 1 (2,4 two chlorophenyl) ethanol was added into the buffer solution and added a certain amount of cofactor NAD (P) and isopropanol into the buffer solution and added to the recombinant ketone. The original enzyme was biocatalytic at 30 C, and after the reaction was finished, ethyl acetate was added to the extraction, that is, the product (S) was obtained by the 2 chlorine (two chlorophenyl) ethanol.

【技术实现步骤摘要】
一种卢立康唑中间体的酶法制备方法
本专利技术涉及一种卢立康唑中间体的酶法制备方法,尤其涉及一种利用重组酮还原酶不对称催化生产卢立康唑中间体(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的方法,属于生物制药和生物化工

技术介绍
卢立康唑是日本农药株式会社开发的咪唑类抗真菌药物,其通过抑制羊毛甾醇脱甲基酶从而抑制麦角固醇的合成,减少构成真菌麦角固醇和相对的羊毛甾醇积累,该药适用于真菌治疗,包括体癣、念珠菌病和花斑癣等。与以往抗真菌外用药相比,卢立康唑最大的优势是皮肤贮留率高,用药周期短(为一般药物的一半),疗效好且不易复发,故具有很大的竞争力。卢立康唑的化学结构式如下:(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇是卢立康唑化学合成过程中一个重要的中间体。但目前主要以化学合成为主,但该方法需要使用价格昂贵的手性配体(S,S)-TsDPEN和金属试剂[Ru(p-cymene)Cl2]2,产品收率低,手性ee值不高,化学生产成本大且对环境不优化,不适于规模化生产(CN103044192A)。(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的大规模生物制备方法目前尚未见报道。但(R)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的生物制备,目前已见报道,手性ee值大于99,转化效率大于99(J.Org.Chem.2011,76,2115–2122)。在该文献中亦可见(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的生物转化,但手性ee值不高(ee值90),因此不能满足工业化生产的需要。(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇生物催化的反应路线为:
技术实现思路
针对现有化学法合成卢立康唑中间体(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的不足之处,本专利技术的目的是提供一种利用重组酮还原酶不对称催化生产卢立康唑中间体的方法,使得该中间体的生产经济、环保,从而满足卢立康唑的工业化生产。本专利技术的上述目的是通过如下方案予以实现的:一种卢立康唑中间体的酶法制备方法,所述方法以2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮为底物,在酮还原酶、辅因子及氢供体的存在下,发生不对称还原反应生成(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇,包括如下步骤:(1)酮还原酶的制备:将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含有卡那霉素抗性的液体LB培养基中,37℃过夜培养;将活化后得到的培养物接种到含有卡那霉素的液体LB培养基中,37℃振荡培养至OD600为0.6-0.8,加入终浓度为0.1M的IPTG,于25℃下诱导培养8-10h;离心,收集菌体,超声破壁后即获得重组酮还原酶。(2)(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的制备:将底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮加入到缓冲液中并加入一定量的辅因子NAD(P)及异丙醇,加入重组酮还原酶于30℃进行生物催化反应,待反应结束后,加入乙酸乙酯进行萃取,即获得产物(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇。作为优选:所述步骤(1)的酮还原酶的DNA序列如SEQNO.1所示,其编码的氨基酸序列如SEQNO.2所示;所述步骤(2)中的底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮的浓度为25-50g/L。作为优选:所述步骤(2)中的重组酮还原酶的使用量为10-50g/L;辅因子为NAD+或NADP+,其浓度为0.05-0.1g/L;氢供体为异丙醇,其浓度为5%-10%。作为优选:所述步骤(2)中的缓冲液为磷酸缓冲液,pH为6.5-7.5;所述生物催化反应的温度为25-35℃;所述生物催化反应的时间为8-12h;所述的产物(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的结构式如下:本专利技术采用特定的酮还原酶催化还原反应,具有酶用量小、反应条件温和、操作简单、反应时间短、收率高、光学纯度好和绿色环保等优势。与现有技术的化学法相比,经济性高、污染小,具有重要的工业应用价值。附图说明图1是本专利技术的生物合成路线;图2是本专利技术构建的重组酮还原酶的表达质粒pET26-KRED;图3是大肠杆菌BL21(DE3)/pET26-KRED诱导表达后重组酮还原酶的SDS-PAGE电泳图;其中M是蛋白分子量标准品,1号是破碎后上清液,2号是纯化后的重组酶。图4是产物(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的手性HPLC液相图;图5是产物(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的1HNMR图谱。具体实施方式以下通过附图及实施例对本专利技术作进一步的描述:本专利技术所述的一种卢立康唑中间体的酶法制备方法,所述方法以2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮为底物,在酮还原酶、辅因子及氢供体的存在下,发生不对称还原反应生成(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇,包括如下步骤:(1)酮还原酶的制备:将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含有卡那霉素抗性的液体LB培养基中,37℃过夜培养;将活化后得到的培养物接种到含有卡那霉素的液体LB培养基中,37℃振荡培养至OD600为0.6-0.8,加入终浓度为0.1M的IPTG,于25℃下诱导培养8-10h;离心,收集菌体,超声破壁后即获得重组酮还原酶。(2)(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的制备:将底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮加入到缓冲液中并加入一定量的辅因子NAD(P)及异丙醇,加入重组酮还原酶于30℃进行生物催化反应,待反应结束后,加入乙酸乙酯进行萃取,即获得产物(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇。本专利技术所述步骤(1)的酮还原酶的DNA序列如SEQNO.1所示,其编码的氨基酸序列如SEQNO.2所示;所述步骤(2)中的底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮的浓度为25-50g/L。本专利技术所述步骤(2)中的重组酮还原酶的使用量为10-50g/L;辅因子为NAD+或NADP+,其浓度为0.05-0.1g/L;氢供体为异丙醇,其浓度为5%-10%。本专利技术所述步骤(2)中的缓冲液为磷酸缓冲液,pH为6.5-7.5;所述生物催化反应的温度为25-35℃;所述生物催化反应的时间为8-12h;所述的产物(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的结构式如下:实施例1:(1)羰基还原酶原始基因的合成:根据羰基还原酶LKADH的原始基因序列,按照大肠杆菌密码子分析用表对原始基因序列进行密码子优化并进行目的基因的全合成,合成后的全基因两端分别带用NdeI和XhoI酶切位点并连接到pET26b(+)上,获得重组表达载体pET26b-LKADH。优化的LKADH原始基因序列如SEQNO.1所示,其编码的氨基酸序列如SEQNO.2所示。(2)羰基还原酶突变体的构建:(3)羰基还原酶的表达:将重组表达载体pET26b-LKADH和pET26b-LKADHM通过热激转化法转到表达菌株BL21(DE3)中。挑取单菌落,将单菌落接入到5mL含卡那霉素的LB培养液中,37℃,振荡培养过夜,次日取1mL菌液加入到含卡那霉素的100mLTB培养基中,37℃下振荡培养至OD600至3.0,然后添加IPTG至终浓度为0.1mM,25℃下诱导培养过夜。(4)细胞破碎:5000g离心10min后收集菌体,用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)缓冲液重悬菌体,超声破碎后所得液体即为粗酶液。(5)酶催化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种卢立康唑中间体的酶法制备方法,所述方法以2‑氯‑1‑(2,4‑二氯苯基)乙酮为底物,在酮还原酶、辅因子及氢供体的存在下,发生不对称还原反应生成(S)‑2‑氯‑1‑(2,4‑二氯苯基)乙醇,其特征在于包括如下步骤:(1)酮还原酶的制备:将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含有卡那霉素抗性的液体LB培养基中,37℃过夜培养;将活化后得到的培养物接种到含有卡那霉素的液体LB培养基中,37℃振荡培养至OD600为0.6‑0.8,加入终浓度为0.1M的IPTG,于25℃下诱导培养8‑10h;离心,收集菌体,超声破壁后即获得重组酮还原酶。(2)(S)‑2‑氯‑1‑(2,4‑二氯苯基)乙醇的制备:将底物2‑氯‑1‑(2,4‑二氯苯基)乙酮加入到缓冲液中并加入一定量的辅因子NAD(P)及异丙醇,加入重组酮还原酶于30℃进行生物催化反应,待反应结束后,加入乙酸乙酯进行萃取,即获得产物(S)‑2‑氯‑1‑(2,4‑二氯苯基)乙醇。

【技术特征摘要】
1.一种卢立康唑中间体的酶法制备方法,所述方法以2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮为底物,在酮还原酶、辅因子及氢供体的存在下,发生不对称还原反应生成(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇,其特征在于包括如下步骤:(1)酮还原酶的制备:将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含有卡那霉素抗性的液体LB培养基中,37℃过夜培养;将活化后得到的培养物接种到含有卡那霉素的液体LB培养基中,37℃振荡培养至OD600为0.6-0.8,加入终浓度为0.1M的IPTG,于25℃下诱导培养8-10h;离心,收集菌体,超声破壁后即获得重组酮还原酶。(2)(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的制备:将底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮加入到缓冲液中并加入一定量的辅因子NAD(P)及异丙醇,加入重组酮还原酶于30℃进行生物催化反应,待反应结束后,加入乙酸乙酯进行萃取,即获得...

【专利技术属性】
技术研发人员:唐云平郑佳文余芳苗杨最素丁国芳
申请(专利权)人:浙江海洋大学
类型:发明
国别省市:浙江,33

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