一种双功能载体在抑制HBV感染中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及PD‑L1和HBx靶基因沉默RNA双表达载体在抑制HBV感染中的应用。与单功能载体相比，本发明专利技术构建得到的pSIREN‑shPD‑L1‑shHB对HepG2.2.15细胞增殖的抑制效果更好，对细胞凋亡也有更好地促进作用，通过Western Blot检测胞内抗凋亡蛋白表达情况，发现双功能载体组能明显下调Bcl‑2和Bcl‑xl的表达，定量PCR检测胞内抗凋亡蛋白基因表达情况，发现双功能载体组能明显下调Bcl‑2和Bcl‑xl的mRNA表达。

Application of a bifunctional vector in inhibiting HBV infection

The invention belongs to the field of gene engineering technology, and specifically relates to the application of PD double L1 and HBx target gene silencing RNA double expression vector in inhibiting HBV infection. Compared with the single function carrier, the pSIREN shPD L1 shHB has a better inhibitory effect on the proliferation of HepG2.2.15 cells, and has a better effect on the cell apoptosis. The expression of the intracellular anti apoptotic protein in the cell can be detected by Western Blot, and the expression of the dual function carrier group can obviously decrease the expression of Bcl 2 and Bcl XL. Quantitative PCR was used to detect the expression of intracellular anti apoptotic protein gene. It was found that the double functional vector group could significantly down regulate the expression of mRNA Bcl and 2 Bcl XL.

【技术实现步骤摘要】
一种双功能载体在抑制HBV感染中的应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及PD-L1和HBx靶基因沉默RNA双表达载体在抑制HBV感染中的应用。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)最早被鉴定于1966年，是一种主要经过消化道或血液等体液途径传播的嗜肝性DNA病毒。慢性HBV感染是导致肝炎、肝硬化以及肝癌的一个重要原因。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)，是指由小非编码RNA诱导mRNA降解、翻译抑制或促使异染色质形成等，进而沉默基因表达，产生相应的功能表型缺失的现象。该技术的诞生使得人们可以根据自己的需要高效、特异地沉默病毒mRNA，从而抑制病毒抗原产生，为病毒感染及相关疾病治疗提供了一柄利器。HBV是目前已知的感染人类最小的双链DNA病毒，但由于具有重复的基因序列，故其基因排列紧密，利用率高，能够编码病毒生存需要的多种成分，同时，HBV在自我复制过程中是利用自身pgRNA(前基因组RNA)来逆转录合成DNA。所以RNAi不仅可以沉默靶向HBV基因抑制其蛋白表达，也可以沉默HBVpgRNA抑制病毒复制，故慢性HBV感染适合于RNAi技术治疗。另外，T细胞在HBV感染中发挥着至关重要的抗病毒作用，但是在HBV慢性感染患者体内，T细胞的功能低下并且趋于凋亡，呈现一种耗竭的状态。研究发现，与健康人相比，CHB病人肝细胞表面的共抑制性分子PD-L1表达明显上调，并且，大量研究发现，利用阻断性抗体阻断PD-L1/PD-1信号通路可以逆转CD8+T细胞功能的耗竭和增强机体抗病毒能力。因此，利用RNAi干扰技术对该免疫检查点分子的靶向治疗可能会为我们在抗HBV治疗中带来新的曙光。
技术实现思路
本专利技术的目的是，通过构建PD-L1和HBx靶基因沉默RNA双表达载体，转染被病毒感染的细胞后既能沉默病毒自身成分抑制其生命周期，又能沉默宿主表面的免疫抑制分子来增强机体的抗病毒免疫反应，进而对慢性HBV病毒感染起到有效的治疗。为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：本专利技术提供一种双功能载体在抑制HBV中的应用，所述双功能载体靶向于PD-L1和HBx的RNAi双功能载体。本专利技术通过实验证明，与单功能载体组相比，双功能载体对细胞增殖的抑制效果更好，通过WesternBlot检测胞内信号通路蛋白的变化，发现双功能载体组能明显下调p-mTOR蛋白的表达；与单功能载体组相比，双功能载体对细胞凋亡有更好地促进作用，通过WesternBlot检测胞内抗凋亡蛋白表达情况，发现双功能载体组能明显下调Bcl-2和Bcl-xl的表达，定量PCR检测胞内抗凋亡蛋白基因表达情况，发现双功能载体组能明显下调Bcl-2和Bcl-xl的mRNA表达。附图说明图1为筛选沉默效果较好的PD-L1siRNA序列；其中：CTRL组为未加入转染试剂和siRNA组Lipo2000为只加入转染试剂组；1,2,3为PD-L1的SEQIDNO.1，SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的三条siRNA转染组。图2为HBxsiRNA沉默效果的基因水平验证图，其中：CTRL组为未加入转染试剂和siRNA组，Lipo2000为只加入转染试剂组，HBxsiRNA为siRNA转染组。图3为HBxsiRNA沉默效果的蛋白水平验证图，其中：CTRL组为未加入转染试剂和siRNA组，Lipo2000为只加入转染试剂组，HBxsiRNA为siRNA转染组。图4为构建的单/双功能载体对HBx沉默效果的基因水平，其中：lipo2000为只加入转染试剂组，Vector为空载体转染组，shHBx为pSIREN-shHBx载体转染组，shPD-L1为pSIREN-shPD-L1载体转染组，Dual为pSIREN-shPD-L1-shHBx双功能载体转染组。图5为构建的单/双功能载体对HBx沉默效果的基因水平；其中：lipo2000为只加入转染试剂组，Vector为空载体转染组，shHBx为pSIREN-shHBx载体转染组，shPD-L1为pSIREN-shPD-L1载体转染组，Dual为pSIREN-shPD-L1-shHBx双功能载体转染组。图6为构建的单/双功能载体对HBx沉默效果的蛋白水平验证；其中：lipo2000为只加入转染试剂组，Vector为空载体转染组，shHBx为pSIREN-shHBx载体转染组，shPD-L1为pSIREN-shPD-L1载体转染组，Dual为pSIREN-shPD-L1-shHBx双功能载体转染组。图7为构建的单/双功能载体对HBx沉默效果的基因水平蛋白水平验证，其中：lipo2000为只加入转染试剂组，Vector为空载体转染组，shHBx为pSIREN-shHBx载体转染组，shPD-L1为pSIREN-shPD-L1载体转染组，Dual为pSIREN-shPD-L1-shHBx双功能载体转染组。图8为双表达载体能够抑制HepG2.2.15细胞的增殖；其中：lipo2000为只加入转染试剂组，Vector为空载体转染组，shHBx为pSIREN-shHBx载体转染组，shPD-L1为pSIREN-shPD-L1载体转染组，Dual为pSIREN-shPD-L1-shHBx双功能载体转染组。图9为双表达载体能够下调胞内增殖相关的信号通路蛋白；其中：lipo2000为只加入转染试剂组，Vector为空载体转染组，shHBx为pSIREN-shHBx载体转染组，shPD-L1为pSIREN-shPD-L1载体转染组，Dual为pSIREN-shPD-L1-shHBx双功能载体转染组。图10为双表达载体能够促进HepG2.2.15细胞的凋亡；其中：lipo2000为只加入转染试剂组，Vector为空载体转染组，shHBx为pSIREN-shHBx载体转染组，shPD-L1为pSIREN-shPD-L1载体转染组。图11为双表达载体能够明显下调胞内抗凋亡蛋白蛋白水平的图。图12为双表达载体能够明显下调胞内抗凋亡蛋白基因水平的图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。本专利技术提供一种双功能载体在抑制HBV中的应用，所述双功能载体为靶向于PD-L1和HBx的RNAi双功能载体。进一步地，所述双功能载体在抑制细胞生长中的应用。进一步地，所述双功能载体在改变细胞内信号通路方面中的应用。进一步地，所述双功能载体在促进细胞凋亡中的应用。进一步地，PD-L1基因的特异性沉默siRNA核苷酸序列如SEQIDNO.1，SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。在本专利技术最佳技术方案中，选择的人源的PD-L1基因的特异性沉默siRNA序列为SEQIDNO.1所示序列更进一步地，所用载体为pSIRE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双功能载体在抑制HBV感染中的应用，其特征在于，靶向于PD‑L1和HBx的RNAi双功能载体。

【技术特征摘要】
1.一种双功能载体在抑制HBV感染中的应用，其特征在于，靶向于PD-L1和HBx的RNAi双功能载体。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述双功能载体在抑制细胞生长中的应用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述双功能载体在改变细胞内信号通路方面中的应用。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，双功能载体在促进细胞凋亡中的应用。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，PD-L1基因的特异性沉默siRNA核苷酸序列如SEQIDNO.1，SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所用表达载体为pSIREN。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，HBxsiRNA核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建，赵荣荣，韩秋菊，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37