一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法技术

技术编号:18455663 阅读:61 留言:0更新日期:2018-07-18 11:31
本发明专利技术公开了一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法,包括以下步骤:S1、安全靶点筛选及靶点绑定gRNA切割效率验证;S2、构建同源臂供体质粒,并获得定点整合转基因细胞系;S3、外源DNA定点整合转基因猪的构建。本发明专利技术在供体质粒中引入gRNA靶点序列,利用细胞内转录gRNA诱导Cas9核酸酶切割靶基因同时,线性化供体质粒,大大简化试验步骤,节约人力,且有利于提高共转染效率。本发明专利技术定点整合所用载体较少,同源臂大小适中,更有利于获得转基因细胞系,将高效定点整合技术,高活力定点转基因细胞培育技术与体细胞克隆技术结合,有利于定点整合转基因动物高效制备,加快转基因动物新品种培育速度。

Construction of a transgenic pig with fixed point integration of exogenous DNA

The present invention discloses a method of constructing a fixed-point integration of exogenous DNA transgenic pigs, including the following steps: S1, screening of safety targets and validation of target binding gRNA cutting efficiency; S2, construction of homologous arm donor plasmids, and obtained fixed-point integration of transgenic cell lines; S3, foreign DNA setting integration of transgenic pigs. This invention introduces the gRNA target sequence in the donor plasmid, uses the intracellular transcriptional gRNA to induce the Cas9 nuclease to cut the target gene and linearize the donor plasmid, greatly simplifying the test steps, saving manpower and improving the efficiency of CO transfection. The fixed-point integration has less carrier and moderate size of the homologous arm, which is more conducive to the acquisition of transgenic cell lines. It combines highly efficient fixed-point integration technology, high vitality fixed point transgenic cell cultivation technology and somatic cell cloning technology, which is beneficial to the efficient preparation of genetically modified animals in fixed-point integration and speed up the cultivation of new varieties of transgenic animals. Speed.

【技术实现步骤摘要】
一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法
本专利技术属于生物
,主要涉及一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法,应用于制备定点整合外源DNA片段的转基因动物,适用于长片段多基因定点整合转基因动物新品种培育。
技术介绍
转基因大动物的获得依赖于体细胞克隆技术(SCNT),成功构建相关转基因细胞系是转基因大动物获得的关键步骤。传统转基因技术,如显微注射,转座子,病毒载体包被侵染等把目的基因插入基因组内的整合方式是随机的,这些随机整合对后期转基因动物品系组建和育种带来诸多不利,因此急需开发高效的定点整合转基因技术,构建定点整合外源DNA的转基因细胞系,用于家畜新品种培育。动物基因组定点整合转基因技术是指动物基因组靶位点产生DNA双链断裂(double-strandbreak,DSB)后,通过同源重组修复(homologous-directedrepair,HDR)机制,微同源重组机制(MMEJ)及单链寡核苷酸(SSODN)介导的重组修复机制,将外源基因及其调控区整合特定靶位点,获得定点整合外源基因的转基因动物。定点整合技术的效率主要取决于两个方面,一是靶位点产生双链断裂(DSB)的效率。二是断裂后的靶位点与携带同源臂及外源基因的供体质粒(donorplasmid)发生重组的效率。传统同源重组技术依赖自然DSB产生,利用供体同源重组模板和自然产生的DSB,重组效率仅10-5e~10-7e,为科研和生产带来了极大的困难。有研究报道为矫正小鼠β-globin基因突变,需要提供8kb~24kb以上的同源序列,才能发生低频重组(0.48%~2.05%)。同源序列过长会增加供体质粒构建难度同时导致较低的转染效率,传统的同源重组技术成功率极低。随着基因编辑技术突飞猛进,如ZFN、Talen和CRISPR/Cas9等,在基因组特定位点高效获得DSB已不再是同源重组的限制性条件。如在斑马鱼中研究显示,利用Talen技术,借助238bp~1168bp的左臂和673bp~3716bp的右臂,可轻松实现小片段2A-GFP基因(约700bp)定点插入Sox2基因下游,整合效率10~90%。2015年,Byrne等使用CRISPR/Cas9系统将人内源hTHY1基因(2.7kb)置换为鼠源mTHY1(2.5kb)时,发现置换效率与同源臂长度和同源臂长度比例有关,当右臂不变时(R2466bp),置换效率随左臂长度增加而升高(L100~800bp),但L821与L1550效率接近(17.8%Vs16.8%),均高于L4573bp和R4803bp组(10.1%)。Kung等(2013)研究显示,将1.1kb外源片段整合到叶缘焦枯病菌(Xylellafastidiosa)时,同源臂在96~1000bp范围内,HR效率呈指数上升,但同源臂在1kb~4kb范围,其重组效率不在增加,而是出现平台期。置换效率还有切割位置有关,位于左侧gRNA切割的置换效率高于右测。定点整合效率与整合片段的长度存在正比例的线性关系,片段越大,其重组率越低。Kung等(2013)研究显示,将1.1kb的片段整合到叶缘焦枯病菌的基因组,同源臂1kb时最高,其HR效率为5.62×10-5;但若采用1.1bp同源臂整合的片段长度达到6kb,就检测不到重组的发生。获得整合相同位点的不同家系的转基因动物是转基因新品种培育的基础,但受限于长片段较低的整合效率,转基因新品种培育难度很大。近年来,有学者报道一种PITCh((preciseIntegrationintotargetchromosome)介导基因定点整合技术,结合ZFN、Talen和CRISPR/Cas9高效三大基因编辑系统,利用5~40bp微同源臂,可介导小片段(<1000bp)外源基因高效整合到生物基因组,并在斑马鱼,青蛙,蚯蚓和细胞系CHO,HeLaHEK293T中应用,其KI效率达10%~85%。目前利用该技术可将中等长度片段(5.7kb~9.6kb)整合到CHO细胞,其效率为(10%~17%)[10]。但该技术同源重组效率不稳定,且在长片段定点整合中,效率极低,目前尚无成功实现10kb以上片段定点整合,另外PITCh技术因采用40bp微同源臂,更容易受基因组同源相似序列干扰,其效果并不稳定。Yoshimi等(2005)报道了CRISPR-Cas9结合单链寡核苷酸(ssODN)开发了两种基因改造的新技术,分别为LsODN(longsingle-strandedoligodeoxynucleotide)和2H2OP(two-hittwo-oligowithplasmid)技术[11]。利用显微注射技术,以ssODNs(lsODNs)作为靶向供体,将相应的gRNA和cas9mRNA注射到大鼠受精卵,可将720bp左右的GFP整合到大鼠Thy1基因座整合其效率11.1~13.5%。该技术缺点是SSODN在细胞内容易被核酸外切酶降解,需要侧翼同源臂(HA)在60~300bp以上才能发生KI,并容易在切割位点造成缺失。大于100bp的LSODN合成极其困难,目前国内如华大基因仅能提供100bpSSODN合成,极大限制其应用。2H2OP方法需要共同注射两个gRNAs作为“剪刀”分别切割基因组DNA和供体质粒DNA中的靶位点,接着用两个短ssODNs作为“缝合接头”连接DSB与供体质粒。利用受精卵显微注射技术,该研究小组成功实现了定点导入了近200kb的大片段基因组区域,其效率为1/15(6.7%),并用人源基因替代了大鼠基因,构建出了基因人源化的动物其效率为1/23(4.3%)。但2H2OP方法需要同时导入受精卵2条切割gRNA,2条120bpoligoDNA,供体质粒,仅适合显微注射受精卵技术。对猪等具有重大育种价值的大动物转基因常采用体细胞克隆技术,克隆效率仅0.5%~1.5%,若利用2H2OP技术,其获得KI动物效率仅为0.03%~0.09%,很难获得KI动物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法。根据本专利技术的一个方面,提供了一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法,包括以下步骤:S1、靶点筛选及靶点绑定gRNA切割效率验证;S2、构建同源臂供体质粒,并获得定点整合阳性细胞系;S3、外源DNA定点整合转基因猪的构建。其中,S1步骤包括以下步骤:S1.1、构建sgRNA载体根据定点整合位点基因序列,设计并合成sgRNA引物,再与合成得到的退火双链引物配制混合,在PCR仪中运行如下程序:95℃,5min,10℃,1min;95℃,5min,10℃,1min,95℃,5min,10℃,3min,结束后将退火产物与BbsI线性化后的PX330进行T4连接,连接产物进行转化,挑菌和测序验证,测序引物hU6-F:GAGGGCCTATTTCCCATGATT,构建成功的菌种保存备用;S1.2、电转染与DNA抽提将猪胎儿成纤维细胞复苏后,汇合度达到50%~80%时,使用0.05%Trytin-EDTA消化,终止消化后细胞计数,吸取含有1×106个细胞的悬浮液至新的离心管中,90g离心5min,弃上清,使LonzaAMAXANucleofector2b核转仪进行PX330-s本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:S1、安全靶点筛选及靶点绑定gRNA切割效率验证;S2、构建同源臂供体质粒,并获得定点整合转基因细胞系;S3、外源DNA定点整合转基因猪的构建。

【技术特征摘要】
1.一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:S1、安全靶点筛选及靶点绑定gRNA切割效率验证;S2、构建同源臂供体质粒,并获得定点整合转基因细胞系;S3、外源DNA定点整合转基因猪的构建。2.根据权利要求1所述的定点整合外源DNA转基因猪的构建方法,其特征在于,所述S1步骤包括以下步骤:S1.1、构建sgRNA载体:根据定点整合位点基因序列,设计并合成sgRNA引物,再与合成得到的退火双链引物配制混合,在PCR仪中运行如下程序:95℃,5min,10℃,1min;95℃,5min,10℃,1min,95℃,5min,10℃,3min,结束后将退火产物与BbsI线性化后的PX330进行T4连接,将连接产物进行转化,挑菌和测序验证,构建成功的菌种保存备用;S1.2、电转染与DNA抽提:将猪胎儿成纤维细胞复苏后,汇合度达到50%~80%时,使用0.05%Trytin-EDTA消化,终止消化后细胞计数,吸取含有1×106个细胞的悬浮液至新的离心管中,90g离心5min,弃上清,使用Lonza2b核转仪进行PX330-sgRNA质粒3ug电转染,转染程序为A-033,然后立即转移电转杯中所有细胞至6孔板,培养48小时后,去除上清,取细胞抽提DNA,抽提后的细胞DNA为模板,用外源引物通过PCR仪扩增靶序列片段,将扩增的目的条带切胶回收,回收产物-20℃保存备用;S1.3、gRNA切割效率验证:回收得到的PCR产物,使用T7E1酶进行酶切处理,进行充分混合后,PCR仪上95℃加热5min,95℃-85℃,-2℃/s,85-25℃,-0.1℃/s进行退火,上述反应体系分别加入0.5ulT7E1酶,37℃反应30min后,立刻跑2~3%的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果,同时,切胶回收的PCR产物进行平末端连接,转化,涂板,蓝白斑筛选测序分析,获得gRNA切割效率最佳的靶点进行后续研究。3.根据权利要求1所述的定点整合外源DNA转基因猪的构建方法,其特征在于,S1.2步骤中,所述PCR仪的的反应程序为:98℃2min;98℃10s,55~60℃,5s;72℃,5~60s;35个循环;72℃2min,4℃1h。4.根据权利要求1所述的定点整合外源DNA转基因猪的构建方法,其特征在于,S2步骤包括以下步骤:S2.1、扩增定点整合位点处的侧翼不同长度的同源臂:以猪基因组DNA为模板,从靶序列切割位点侧翼40bp内设计引物,分别扩增不同长度的同源臂序列,PCR反应程序为:98℃2min;98℃10s,55~60℃,5s;72℃,5~60s;35个循环;72℃2min,4℃1h,反应结束后用1%琼脂糖电泳,并将对应目的条带切胶回收,-20℃保存备用;S2.2、酶切与回收目的基因载体:将质粒ppb-mpsp-neoGFP-BEXA使用NotI,XhoI内切酶双酶切后,用1%琼脂糖电泳,并将目的条带切胶回收,-20℃保存备用;S2.3、连接片段,构建供体质粒:使用In-FusionHDCloningkits639648试剂盒进行无缝克隆,连接后转化至Trans2Blue感受态细胞中,转化过程如下:冰浴30min,42℃,45s,然后加入LB培养基复苏30~60min,质粒ppb-mpsp-neoGFP-BEXA带有氨苄抗性,取150ul涂平板,过夜培养后每组挑取6个菌落于500ul抗性培养基中扩大培养并测序,测序正确的菌落留种备用;S2.4、重组供体质粒抽提及纯化:将构建成功的质粒进行抽提及纯化;S2.5、电转染与单克隆细胞筛选:猪胎儿成纤维细胞复苏汇合度达到50%~80%时,使用Lonza核转仪Nucleofector2b,按,将负责切割载体和重组供体质粒混合后共转染猪PFFs细胞,转染条件为:切割载体质粒用量3μg,重组供体质粒10μg。转染程序为A-033,共转后将电转杯中所有细胞均分至10~30个10cm板,添加12%FBS完全培养基,8~10mL/板,轻轻吹打混匀,转染12~24h后,更换含400mg/mlG418、12%FBS筛选培养液,3天后小心移去培养基,使用PBS清洗培养板2-3次,再添加含400mg/mlG418的12%FBS筛选培养液,8~10mL/板,培养3天;第7天,使用PBS清洗...

【专利技术属性】
技术研发人员:吴珍芳张献伟李国玲杨化强莫健新钟翠丽石俊松贺晓燕张健李紫聪蔡更元
申请(专利权)人:广东温氏食品集团股份有限公司华南农业大学
类型:发明
国别省市:广东,44

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