一种基于CRISPR-Cas13a的抑制真核细胞中基因表达水平的方法及其应用技术

涉及基因工程领域，具体公开了一种基于CRISPR‑Cas13a的抑制真核细胞中基因表达水平的方法及其应用。通过设计并合成与目的基因mRNA中某段序列互补的向导RNA，与Cas13a蛋白形成Cas13a‑向导RNA复合物；在真核细胞中，该复合物在向导RNA的引导下，与序列互补的目的基因mRNA结合并激活Cas13a蛋白的RNA降解活性，从而引起目的基因mRNA的降解和表达水平抑制。另外，通过向导RNA的位置筛选，以及人为添加错配的方式，该方法可以高效并特异性抑制单碱基突变的癌基因表达水平，同时不影响野生型基因表达。通过向导RNA设计，本方法可用于真核细胞中的基因表达沉默以及单碱基突变的癌基因表达特异性抑制，具有特异性高、稳定准确、简便快速的特点。

A method of inhibiting gene expression level in eukaryotic cells based on CRISPR-Cas13a and its application

In the field of genetic engineering, a method of inhibiting gene expression level in eukaryotic cells based on CRISPR Cas13a is specifically disclosed and its application. Through the design and synthesis of a guide RNA complementary to a sequence in the target gene mRNA, and the formation of the RNA complex of the Cas13a guide RNA with the Cas13a protein, in eukaryotic cells, the complex is combined with the sequence complementary target gene mRNA and activates the RNA degradation activity of the Cas13a protein under the guidance of the wizard RNA, thus causing the target gene mRNA. Degradation and expression level inhibition. In addition, this method can effectively and specifically inhibit the expression of oncogene expression of single base mutation, without affecting the expression of wild type gene, by selecting the location of the guide RNA and adding mismatch. Through the design of the guide RNA, this method can be used in the gene expression silencing in eukaryotic cells and the specific inhibition of the oncogene expression of single base mutation. It has the characteristics of high specificity, stability, simplicity and simplicity.

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR-Cas13a的抑制真核细胞中基因表达水平的方法及其应用方法领域本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种基于CRISPR-Cas13a的抑制真核细胞中基因表达水平的方法及其应用。背景方法随着医学发展，人们逐渐认识到基因的异常表达或突变是许多疾病发生发展的关键，特别是在恶性肿瘤中，存在大量的癌基因突变，其中数量最多的就是单碱基突变。针对某些突变致病基因，人们可以设计合成出小分子抑制剂，特异性地抑制这些突变蛋白的功能；然而，仍有一些突变基因在蛋白水平上，缺乏可以设计抑制剂的位点，因此，在基因表达水平进行特异性抑制是目前医学发展中的一个关键问题。目前，最主流的基因表达抑制工具仍是已经发展了20年左右的RNA干扰技术。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)，又称转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)，是指将特异性同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，使目的基因不表达或表达水平下降。但是这种技术在特异性上存在不足之处，具有明显的脱靶效应，而且无法识别单碱基突变的癌基因，因此亟待开发出新的基因表达抑制技术。1987年，科学家在细菌的基因组中发现了一些成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)；随后又在这些重复序列的附近发现了CRISPR相关蛋白(Cas)的基因。随着基因组学和生物信息学的发展，科学家注意到这些CRISPR序列与许多病毒或噬菌体的DNA序列是互补的，人们逐渐认识到Cas蛋白可以在这些CRISPR序列的帮助下，对这些互补的基因序列进行切割破坏，这些结果表明CRISPR-Cas系统是原核生物进化出的专门应对病毒等外来入侵者的特异性防御机制。随着大量不同的CRISPR-Cas系统被发现出来，根据最终基因切割效应复合物的组成结构，人们将CRISPR-Cas系统分为2个家族，第一个家族包括1型和3型Cas，其切割效应复合物需要多种Cas蛋白参与组成；第二个家族包括2型Cas，其效应复合物只需要一个Cas蛋白组成，因此受到更多的关注。对于2型Cas来说，仅仅需要一个Cas蛋白和一段向导RNA，就可以对靶向基因序列进行精确切割和编辑。目前，2型Cas主要包括Cas9、Cas12a(也成为Cpf1)、Cas13a(曾被称为C2c2)。与Cas9和Cas12a以DNA为靶向核酸不同，Cas13a是以RNA为靶向核酸序列。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于CRISPR-Cas13a的抑制真核细胞中基因表达水平的方法。通过设计并合成与目的基因mRNA中某段序列互补的向导RNA，与Cas13a蛋白形成Cas13a-向导RNA复合物；在真核细胞中，该复合物在向导RNA的引导下，与序列互补的目的基因mRNA结合并激活Cas13a蛋白的RNA降解活性，从而引起目的基因mRNA的降解和表达水平抑制。另外，通过向导RNA的位置筛选，以及人为添加错配的方式，该技术可以高效并特异性抑制单碱基突变的癌基因表达水平，同时不影响野生型基因表达。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一、基于CRISPR-Cas13a的抑制真核细胞中基因表达水平的方法。该方法最终发挥基因表达抑制功能的效应器是Cas13a-向导RNA复合物。本专利技术中Cas13a蛋白可以来自不同细菌，如Leptotrichiashahii(LshCas13a)，Leptotrichiabuccalis(LbuCas13a)，Leptotrichiawadei(LwCas13a)等，优选为LwCas13a。本专利技术中向导RNA的包括锚定序列以及与目的基因互补的向导序列，结构为5’-锚定序列-向导序列-3’，其中锚定序列与Cas13a蛋白的菌属来源有关，分为针对LshCas13a的5’-GGCCACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAAC-3’,针对LbuCas13a的5’-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAAC-3’和针对LwCas13a的5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC-3’；向导序列与目的基因mRNA中某段序列互补，长度为20-28个碱基，优选为28个。本专利技术中Cas13a-向导RNA复合物可以通过蛋白纯化和体外转录的方式，提前形成后转染进入真核细胞；也可以通过外源基因质粒导入的方式，在真核细胞内实现外源性Cas13a和向导RNA表达后，直接在细胞内形成Cas13a-向导RNA复合物。优选为提前形成复合物后转染进入真核细胞。二、基于CRISPR-Cas13a的真核细胞基因表达抑制方法用于单碱基突变的癌基因表达特异性抑制。在本应用中，可通过向导RNA的精准设计，实现对单碱基突变的癌基因进行高效的特异性抑制：通过向导RNA的位置筛选可以实现对基因表达抑制效率的优化；通过人为添加错配的方式，可以实现对基因表达抑制特异性的优化。在进行向导RNA的位置筛选时，向导RNA中的向导序列应覆盖单碱基突变位点，向导序列最多有28个碱基，因此最多有28个位置选择；不同位置的向导RNA的基因表达抑制水平不同，可以筛选出抑制效率最高的向导RNA。在进行人为添加错配时，人为添加的错配位点应与单碱基突变位点不同，添加错配通常为1-2个，从而使向导RNA中向导序列与野生型基因的错配数量为2-3个(包括1-2个人为添加错配和1个单碱基突变)；错配数量会明显影响Cas13a-向导RNA复合物的基因表达抑制效率，从而实现Cas13a-向导RNA复合物仅能特异性抑制单碱基突变的癌基因表达，同时不影响野生型基因表达。本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开了一种基于CRISPR-Cas13a的抑制真核细胞中基因表达水平的方法，其最主要的机制是通过设计并合成与目的基因mRNA中某段序列互补的向导RNA，与Cas13a蛋白形成Cas13a-向导RNA复合物；在真核细胞中，该复合物在向导RNA的引导下，与序列互补的目的基因mRNA结合并激活Cas13a蛋白的RNA降解活性，从而引起目的基因mRNA的降解和表达水平抑制。本专利技术公开的基于CRISPR-Cas13a的基因表达抑制方法与以往的小干扰RNA技术具有完全不同的生物学机制，最大抑制效率接近，可以达到90％。相比于小干扰RNA需要双链RNA，向导RNA的设计合成更加简便，只需一条单链向导RNA。本专利技术同时公开了该基于CRISPR-Cas13a的真核细胞基因表达抑制方法用于单碱基突变的癌基因表达特异性抑制。在本应用中，通过向导RNA的位置筛选，以及人为添加错配的方式，该方法可以高效并特异性抑制单碱基突变的癌基因表达水平，同时不影响野生型基因表达。这对于单碱基突变的肿瘤治疗意义重大，特别是突变癌基因在蛋白水平上无法设计有效的抑制剂时，如KRAS突变。专利技术人选用KRAS野生型细胞HEK293T和KRAS-G12D突变型胰腺癌细胞AsPC1作为模型，按照本专利技术公布的基因表达抑制方法对两种细胞中的KRAS基因表达水平进行干扰，结果显示，通过精准的向导RNA的位置筛选，本专利技术所述方法可以实现抑制超过90％的KRAS-G12D基因表达，同时通过人为添加错配，可以同时实现对野生型KRAS基因的表达无明显影响本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR‑Cas13a的抑制真核细胞中基因表达水平的方法，其特征在于，通过设计并合成与目的基因mRNA中某段序列互补的向导RNA，与Cas13a蛋白形成Cas13a‑向导RNA复合物；在真核细胞中，该复合物在向导RNA的引导下，与序列互补的目的基因mRNA结合并激活Cas13a蛋白的RNA降解活性，从而引起目的基因mRNA的降解和表达水平抑制。

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR-Cas13a的抑制真核细胞中基因表达水平的方法，其特征在于，通过设计并合成与目的基因mRNA中某段序列互补的向导RNA，与Cas13a蛋白形成Cas13a-向导RNA复合物；在真核细胞中，该复合物在向导RNA的引导下，与序列互补的目的基因mRNA结合并激活Cas13a蛋白的RNA降解活性，从而引起目的基因mRNA的降解和表达水平抑制。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过向导RNA的位置筛选，以及人为添加错配的方式，该方法可以高效并特异性抑制单碱基突变的癌基因表达水平，同时不影响野生型基因表达。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所用Cas13a蛋白可以来自不同细菌，如Leptotrichiashahii，Leptotrichiabuccalis，Leptotrichiawadei等。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所用向导RNA包括锚定序列以及与目的基因互补的向导序列，其中锚定序列与Cas13a蛋白的菌属来源有关，向导序列与目的基因mRNA中某段序列互补，长度为20-28个...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂广军，赵潇，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：北京,11