一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ制造技术

技术编号:18455660 阅读:96 留言:0更新日期:2018-07-18 11:31
本发明专利技术公开了一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ在亚单位疫苗中的应用,利用原核表达方法制备得到该重组蛋白,具体包括:以迟缓爱德华菌ET‑CL基因组序列为模板,PCR扩增flgJ基因;构建pMD18‑T‑flgJ载体,对flgJ基因进行序列测定;构建重组表达载体pET‑32a‑flgJ;将重组表达载体转化DH5α感受态细胞,挑取单克隆进行PCR和双酶切验证,获得阳性克隆,提取质粒,测序;转化BL21工程菌,进行重组蛋白的原核表达;利用SDS‑PAGE分析重组蛋白表达情况;对重组蛋白进行Western blot验证。本发明专利技术通过原核表达系统对迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ进行表达纯化,通过动物实验证明该重组蛋白具有免疫保护力,表明该重组蛋白能够用于研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗。

A flagellin protein FlgJ with delayed immunity against Edward's disease

The invention discloses the application of a kind of retarded Edward flagellin FlgJ with immune protection in subunit vaccine. The recombinant protein is prepared by the prokaryotic expression method, which includes the template of the ET CL genomic sequence of the ET bacterium tarda, the PCR amplification of the flgJ gene, and the construction of the pMD18 T flgJ vector, to f. The lgJ gene was sequenced, and the recombinant expression vector, pET 32a flgJ, was constructed, and the recombinant expression vector was transformed into DH5 alpha receptive cells, and the monoclonal was tested by PCR and double enzyme digestion, and the positive clones were obtained, the plasmid was extracted and sequenced, and the recombinant protein was transformed into the prokaryotic expression of the recombinant protein, and the recombinant protein was reorganized by SDS PAGE analysis. The expression of protein was verified by Western blot. The prokaryotic expression system was used to express and purify the flagellin FlgJ of Edward bacteria, and the recombinant protein was proved to have protective immunity through animal experiments, indicating that the recombinant protein could be used in the development of the subunit vaccine of the slow Edward bacteria.

【技术实现步骤摘要】
一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ
本专利技术涉及生物工程
,具体地说,涉及一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ。
技术介绍
迟缓爱德华菌(Edwardsiellatarda,E.tarda)在水产养殖中十分普遍,危害巨大。目前生产上针对迟缓爱德华菌感染主要通过抗生素和化学药物进行应对,但由此造成的水体污染和菌株耐药情况,不容乐观,特别是多重耐药菌株的不断出现给该病防控带来严峻挑战。此外,E.tarda人兽共患,且近年来人感染病例逐年增加,揭示其重要的公共卫生学意义。目前国内已有针对迟缓爱德华菌病的灭活疫苗和弱毒疫苗获批生产,其中灭活疫苗免疫效果差强人意,弱毒疫苗设计专为大菱鲆使用,远远无法满足多元化水产养殖的需求。开发高效的、满足不同动物使用的迟缓爱德华菌疫苗仍在研究当中,基于保护性抗原筛选研究的亚单位疫苗和活载体疫苗研究是一个重要方向。研究发现,细菌鞭毛蛋白具有优良的免疫原性,同时能够促进吞噬细胞的吞噬作用起到免疫增强作用,具有一定的应用前景。基于此,本专利技术通过原核表达系统对迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ进行表达纯化,通过动物实验证明该重组蛋白具有免疫保护力,为进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ,具体通过原核表达方法,获得迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ的重组蛋白,从而进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗。为实现上述目的,本专利技术采用如下技术方案:具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ在亚单位疫苗中的应用。进一步,所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ的制备方法,具体步骤如下:(1)以迟缓爱德华菌ET-CL基因组序列为模板,P1和P2为引物,PCR扩增flgJ基因;PCR扩增的反应体系为2×TaqPCRMix10μL,引物P1(20μM)和P2(20μM)各1μL,模板1μL,ddH2O7μL,共20μL;PCR扩增反应程序为94℃预变性5min,94℃30s,54℃30s,72℃60s,25个循环,72℃10min;其中引物P1和P2为:P1:5’-gGAATTCATGGCCGACGATAGCCTGGCGTTTA-3’,EcoRI;SEQIDNO:1;P2:5’-gcGTCGACCTAAAACAGATTCGCCAAATCGTGG-3’,SalI;SEQIDNO:2。其中,小写字母为保护碱基,下划线部分为酶切位点;(2)构建pMD18-T-flgJ载体,对flgJ基因进行序列测定;(3)利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ对pMD18-T-flgJ载体和pET-32a载体分别进行双酶切,构建重组表达载体pET-32a-flgJ;(4)将重组表达载体转化DH5α感受态细胞,挑取单克隆进行PCR和双酶切验证,获得阳性克隆,提取质粒,测序;(5)将重组表达载体pET-32a-flgJ和空载体pET-32a分别转化BL21工程菌,进行重组蛋白的原核表达;(6)利用SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况;(7)对重组蛋白进行Westernblot验证。优选的,所述转化BL21工程菌的具体步骤如下:分别将5μL重组载体pET-32a-flgJ和5μL空载体pET-32a加入到100μLBL21工程菌中;冰浴30min,42℃热击90s,再冰浴5min;加入1mL液体LB培养基,37℃复壮1h后,各取5μL涂布于氨苄终浓度为100μg/mL的固体LB平板,倒置,37℃培养过夜。优选的,所述Westernblot验证以His-Mab为一抗、HRP-IgG为二抗。本专利技术的有益效果是:本专利技术利用原核表达系统对迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ进行表达纯化,通过动物实验评估该重组蛋白的免疫保护力,从而进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗。本专利技术利用原核表达方法获得的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ免疫昆明鼠,能够激发机体产生高水平的血清抗体,证实了其具有较强的免疫原性,用迟缓爱德华菌强毒株对免疫小鼠进行攻毒,70%的免疫小鼠得到保护,证实了该蛋白具有一定的免疫保护效果。附图说明:图1为本专利技术实施例1中flgJ基因的PCR扩增;M:DL2000Marker;1:flgJ基因扩增;图2为本专利技术实施例2中flgJ基因的序列分析;图3为本专利技术实施例4中SDS-PAGE分析重组蛋白在大肠杆菌中的表达;M.蛋白Marker;1.pET-32a-flgJ/BL21菌体裂解物;2.pET-32a/BL21空载对照;图4为本专利技术实施例4中Westernblot鉴定重组蛋白在大肠杆菌中的表达;1.重组蛋白FlgJ;2.空载对照;图5为本专利技术实施例4中重组蛋白的可溶性分析;M.蛋白Marker;1.pET-32a-flgJ/BL21菌体裂解物;2.pET-32a-flgJ/BL21裂解物沉淀;3.pET-32a-flgJ/BL21裂解物上清;图6为本专利技术实施例4中纯化的目的蛋白的SDS-PAGE;M.蛋白Marker;1.未纯化的FlgJ蛋白;2.纯化后的FlgJ蛋白;图7为本专利技术实施例4中FlgJ蛋白的免疫原性检测;1.重组蛋白;2.阴性对照(His-σC呼肠孤病毒衣壳蛋白);图8为本专利技术实施例5中重组蛋白对小鼠的免疫保护力;图9为本专利技术实施例5中免疫小鼠血清的抗体水平变化。具体实施方式以下结合附图对本专利技术做进一步的详细描述,所举实例只用于解释本专利技术,并非用于限定本专利技术的范围。实施例1迟缓爱德华菌flgJ基因扩增根据GenBank上登录的E.tarda参考菌株ET-1基因组序列(CP001135.1)flgJ基因设计引物,引物P1和P2为:P1:5’-gGAATTCATGGCCGACGATAGCCTGGCGTTTA-3’,EcoRI;SEQIDNO:1;P2:5’-gcGTCGACCTAAAACAGATTCGCCAAATCGTGG-3’,SalI;SEQIDNO:2;利用细菌基因组提取试剂盒提取E.tarda基因组,以其作为模板PCR扩增flgJ基因,获得963bp大小的条带(如图1所示);PCR反应体系为:2×TaqPCRMix10μL,引物P1(20μM)和P2(20μM)各1μL,模板1μL,ddH2O7μL,共20μL;PCR反应程序为:94℃预变性5min,94℃30s,54℃30s,72℃60s,25个循环,72℃10min。实施例2迟缓爱德华菌flgJ基因序列分析构建pMD18-T-flgJ载体,反应体系为10μL体系:flgJ基因4.5μL,pMD18-T0.5μL,2×Connectbuffer5μL,16℃连接过夜,将其转化DH5α感受态细胞,氨苄抗性平板筛选,获得阳性菌株,由生工生物公司进行序列测定,参照GenBank中E.tarda参考菌株及其它肠杆菌科细菌flgJ基因序列对测序结果进行比对分析,发现爱德华菌属成员间flgJ基因高度保守,达80%以上,但与其他细菌相比缺少序列同源性,结果如图2所示。实施例3pET-32a-flgJ重组表达载体的构建利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ对pMD18-T-flgJ载体和pET-32a载体分别进行双酶切,双酶切的体系为:pMD18-T-flgJ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ在亚单位疫苗中的应用。

【技术特征摘要】
1.具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ在亚单位疫苗中的应用。2.根据权利要求1所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ的制备方法,其特征在于,具体步骤如下:(1)以迟缓爱德华菌ET-CL基因组序列为模板,P1和P2为引物,PCR扩增flgJ基因;其中引物P1和P2为:P1:5’-gGAATTCATGGCCGACGATAGCCTGGCGTTTA-3’,EcoRI;SEQIDNO:1;P2:5’-gcGTCGACCTAAAACAGATTCGCCAAATCGTGG-3’,SalI;SEQIDNO:2;(2)构建pMD18-T-flgJ载体,对flgJ基因进行序列测定;(3)利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ对pMD18-T-flgJ载体和pET-32a载体分别进行双酶切,构建重组表达载体pET-32a-flgJ;(4)将重组表达载体转化DH5α感受态细胞,挑取单克隆进行PCR和双酶切验证,获得阳性克隆,提取质粒,测序;(5)将重组表达载体pET-32a-flgJ和空载体pET-32a分别转化BL21工程菌,进行重组蛋白的原核表达;(6)利用SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况...

【专利技术属性】
技术研发人员:张志强高桂生吴同垒史秋梅杨楠
申请(专利权)人:河北科技师范学院
类型:发明
国别省市:河北,13

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