一种特异性刺激抗原的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种特异性刺激抗原的制备方法，使用跨物种蛋白作为特异性刺激抗原，具体的，利用TGF‑β抗体跨物种反应的特性，使用斑马鱼蛋白作为制备人抗体特异性刺激抗原。所述的跨物种蛋白制备方法为：对斑马鱼抑制素B全基因序列进行优化；设计全长拼接引物；构建重组质粒；转染宿主细胞制备抑制素B蛋白，作为制备人抑制素B特异抗体的抗原。本发明专利技术采用以跨物种蛋白作为特异性刺激抗原的方法，以人工合成的跨物种抑制素B蛋白为抗原进行免疫试验，获得了高纯度的抑制素B抗体，为人特异性抗体的获得提供了一种新的免疫策略。

Preparation of a specific stimulant antigen

The present invention relates to a preparation method of a specific stimulating antigen, using a cross species protein as a specific stimulus antigen, specifically, using the characteristics of the trans species reaction of TGF antibody beta antibody, using zebrafish protein as a specific antibody specific antigen for human antibody preparation. The preparation method of cross species protein is to optimize the whole gene sequence of zebrafish inhibin B, design full length splicing primers, construct recombinant plasmids, and transfect host cells to prepare inhibin B protein as the antigen for preparing human inhibin B specific antibody. The present invention adopts the method of using cross species protein as a specific stimulant antigen, using the synthetic trans species inhibin B protein as an antigen for immunization and obtaining a high purity of inhibin B antibody, which provides a new immunization strategy for the acquisition of human specific antibodies.

【技术实现步骤摘要】
一种特异性刺激抗原的制备方法
本专利技术涉及基因工程
，具体来说，涉及一种特异性刺激抗原的制备方法。
技术介绍
抑制素是转化生长因子β(TGF-β)超家族成员之一，是由α和β两个亚单位构成的二聚体糖蛋白激素。α亚单位相对分子质量(Mr)是20000；β亚单位相对分子质量(Mr)是5000-15000，并有βA和βB两种亚型。α和β通过二硫键结合，形成抑制素A(αβA)和抑制素B(αβB)，另外两个β亚基还可形成活化素A(βAβA)、活化素B(βBβB)以及活化素AB(βAβB)。生物体内INH-B有多种分子形式存在，包括成熟(Mr：32000)和不完全成熟(又称前体)的αβ二聚体分子及游离α亚基。用酶联免疫吸附试验(ELISA)还可检测出血浆中的α亚单位前蛋白(Pro-αC)，该蛋白可能是与其他抑制素有交叉反应的前蛋白系列。βB亚基前体为1个由392个氨基酸(aa)残基组成的肽链，成熟βB亚基(115aa)位于此肽链的碳端。不同哺乳动物的βB亚基全长编码区核苷酸序列的同源性大于80％，成熟区核苷酸序列的同源性大于90％，成熟区推导的氨基酸序列的同源性大于96％。抑制素B这种在各个物种间的序列保守性，又导致针对该分子的抗体具有跨物种反应的特性。抑制素/激活素这种亚基多聚体结构，并且不同的亚基自身具有序列机构相似性，造成了在用各自抗体检测时，抗体对各自天然存在的多种聚合体抗原识别的特异性大大降低，所以对各种亚基聚体抗原的实际检测中存在很大的交叉反应，给蛋白检测尤其是酶联免疫吸附试验(ELISA)带来结果上的误差，导致检测结果的准确性无法保证，抑制素B分子这一特性尤为突出。抗体制备最关键的是抗原的选择，目前在INH-Bβ亚基抗体制备中抗原来源基本都是合成多肽，且多为成熟区域C-末端序列，利用合成多肽免疫动物(兔或小鼠)，制备多克隆抗体或者单克隆抗体，并且该多肽同时被用作检测试剂盒的标准曲线或/和质标品，但是检测目标实为天然抑制素B分子，所以检测结果并不准确，需要对的检测结果用天然样品进行校正。标准品也无法像其他蛋白检测那样用倍比稀释的方法做标准曲线，提高了标准曲线的准备难度，和操作的复杂性。应用基因工程技术合成抑制素B全基因序列，制备跨物种重组蛋白，可作为制备人源蛋白抗体的抗原，实现以跨物种蛋白为抗原制备高特异性抗体的技术方案。
技术实现思路
属于TGF-β超家族的抑制素B在检测上具有容易与抑制素A激活素B发生交叉反应的特点，出现该问题的主要原因是制备出的抗体不能特异识别天然结构的人抑制素B分子，市面上的针对抑制素B分子βB链的抗体，还与VA链和/或α链存在交叉反应。为克服现有技术的不足，本专利技术旨在解决制备具有特异性反应抗体所需要的特殊抗原制备方法的问题。为达到上述目的，本专利技术采用以下实施方案：利用抑制素B蛋白分子各亚基间具有序列相似性以及亚基序列高度保守性的特点，及TGF-β超家族蛋白的抗体具有较强跨物种反应的特性，以跨物种蛋白为抗原制备高特异性抗体。可利用斑马鱼蛋白作为制备人源蛋白抗体的抗原。例如：为了制备与人抑制素B反应特异性高的抗体，采用斑马鱼抑制素B蛋白作为抗原。本专利技术的具体实施方案包括：a.使用跨种属蛋白作为特异性刺激抗原。b.使用斑马鱼蛋白作为制备人抗体特性刺激抗原。c.使用斑马鱼抑制素B蛋白作为制备人抑制素B抗体特性刺激抗原。d.使用斑马鱼抑制素B蛋白β链作为制备人抑制素B抗体特性刺激抗原。e.使用斑马鱼抑制素B蛋白β链作为制备人抑制素Bβ链抗体特性刺激抗原。斑马鱼抑制素B蛋白抗原的制备方法，包括以下步骤：(1)对斑马鱼抑制素B全基因序列进行优化获得目的基因，如SEQNO.1所示；(2)设计全长拼接引物，通过限制性内切酶将(1)中合成的目的基因插入载体质粒；(3)将步骤(2)中含目的基因的质粒转化宿主细胞进行表达；(4)培养(3)中转化的宿主细胞，得到含大量重组蛋白的发酵液；(5)对步骤(4)中发酵液进行分离纯化，获得高纯度的重组抑制素B蛋白。进一步的，利用本专利技术技术方案制备的重组抑制素B蛋白免疫BALB/c小鼠，产生抗抑制素B单克隆抗体，通过ProteinA纯化得到纯度＞90％的抗体蛋白；同时，可使用该重组抑制素B蛋白作为制备人源蛋白抗体的抗原。本专利技术的有益效果：利用TGF-β超家族蛋白的抗体具有较强跨物种反应的特性，以跨物种蛋白为抗原制备高特异性抗体，提供了一种新的免疫策略。使用斑马鱼重组抑制素B蛋白作为制备人源蛋白抗体的抗原，用于制备人抑制素B抗体，其纯度可达到90％以上，且活性好，特异性强，可识别天然结构的人抑制素B分子。此外，该方法易于实现由研发小试到工业化生产的成果转化。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。图1.目标序列两端的限制性酶切位点NdeI和HindIII双酶切位点示意图。图2.重组质粒电泳图谱。泳道1未经酶切处理，作为对照，泳道2经酶切处理后出现两条亮带，其中，在1100bp处出现明显亮带。图3.重组蛋白Inhibin，betaB的表达纯化电泳图。图4.抗体纯度验证及WB凝胶电泳图。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术的技术方案做详细描述。需要说明的是，所描述的实施例仅是本专利技术的一部分实施例，不是全部实施例。基于本专利技术的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，都属于本专利技术保护范围。实施例1使用跨物种蛋白作为特异性抗原的策略。利用抑制素B蛋白分子各亚基间具有序列相似性以及亚基序列高度保守性的特点，及TGF-β超家族蛋白的抗体具有较强跨物种反应的特性，可使用跨物种蛋白作为特异性抗原。进一步的，可使用斑马鱼蛋白作为制备人抗体特性抗原。进一步的，可使用斑马鱼抑制素B蛋白作为制备人抑制素B抗体特性抗原。进一步的，可使用斑马鱼抑制素B蛋白β链作为制备人抑制素B抗体特性抗原。更进一步的，可使用斑马鱼抑制素B蛋白β链作为制备人抑制素Bβ链抗体特性抗原。实施例2斑马鱼抑制素B蛋白的制备。S1对斑马鱼抑制素B全基因序列进行优化获得目的基因，如SEQNO.1所示；S2设计全长拼接引物，通过限制性酶切位点NdeI和HindIII将S1中合成的目的基因插入载体质粒pET30a，转化入BL21(DE3)宿主细胞进行表达；S3培养S3中转化的宿主细胞，得到含大量重组蛋白的发酵液；S4对步骤S4中发酵液进行分离纯化，获得高纯度的重组抑制素B蛋白。实施例3纯化后的抑制素B蛋白质检a.抑制素B蛋白稳定性测试(冻融实验)：取一支分装后冻于-80℃的抑制素B蛋白，放置于冰水混合物中待其缓慢融化，融化后无异常现象，说明抑制素B蛋白冻融实验正常。b.抑制素B蛋白浓度测定：测定蛋白浓度采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。c.抑制素B蛋白WB检测：WB实验操作流程参考《蛋白质电泳实验技术》郭尧君著。检测结果如图3。由图3可见，重组抑制素B蛋白SDS-PAGE电泳图谱中，在50kDa处出现亮带，Western-Blot检测相同位置出现目标条带。WesternBlot法测定蛋白的纯度达90％以上。实施例4抑制素B蛋白免疫小鼠采用常规抗体制备方法，以重组抑制素B蛋白作为抗原，免疫宿主BALB/c纯系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性刺激抗原的制备方法，其特征在于：使用跨物种蛋白作为特异性刺激抗原。

【技术特征摘要】
1.一种特异性刺激抗原的制备方法，其特征在于：使用跨物种蛋白作为特异性刺激抗原。2.根据权利要求1所述的特异性刺激抗原的制备方法，其特征在于：使用斑马鱼蛋白作为制备人抗体特异性刺激抗原。3.根据权利要求2所述的特异性刺激抗原的制备方法，其特征在于：使用斑马鱼抑制素B蛋白作为制备人抑制素B抗体特异性刺激抗原。4.根据权利要求3所述的特异性刺激抗原的制备方法，其特征在于：使用斑马鱼抑制素B蛋白β链作为制备人抑制素B抗体特性刺激抗原。5.根据权利要求4所述的特异性刺激抗原的制备方法，其特征在于：使用斑马鱼抑制素B蛋白β链作为制备人抑制素Bβ链抗体特性刺激抗原。6.根据权利要求2-5任一项所述的特异性刺激抗原的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛玲，于和鸣，赵海豹，侯丽，
申请(专利权)人：国家卫生计生委科学技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11