新的草甘膦抗性基因类别制造技术

本公开涉及新草甘膦抗性基因(EPSPS酶)类别、和可用于编码所述酶的核酸。

New glyphosate resistance gene categories

The present disclosure relates to the new glyphosate resistance gene (EPSPS enzyme) category and nucleic acids that can be used to encode the enzyme.

【技术实现步骤摘要】
新的草甘膦抗性基因类别本申请是2013年2月1日提交的申请号为201380017823.9(PCT申请号PCT/US2013/024511)、专利技术名称为“新的草甘膦抗性基因类别”的专利技术专利申请的分案申请。优先权声明本申请要求获得于2012年2月1日提交的美国临时专利申请系列号61/593,555的利益，还要求获得于2012年4月17日提交的美国临时专利申请系列号61/625,222的利益。根据37C.F.R.§1.821(c)或(e)作为ASCII文本文件-提交的序列表的陈述根据37C.F.R.§1.821(c)或(e)，含有ASCII文本格式的序列列表的文件已经和本专利申请一起提交。
本公开涉及植物生物技术。一些实施方案涉及参与N-(膦酰基甲基)甘氨酸代谢的新多肽、编码这些多肽的核酸、以及用于鉴定它们的方法。特定的实施方案涉及包含前述多肽和/或核酸的植物、植物部分、和植物细胞。背景各种杂草很长时间以来都是耕地面临的难题。尽管杂草控制可能是劳动力密集型的操作，但是高效的杀杂草化学除草剂的获得已经使它变得更加容易。除草剂的广泛使用，加上作物品种和肥料的改良，对农业的“绿色革命”做出了显著贡献。特别有用的除草剂是具有广谱除草活性的除草剂。不幸的是，广谱除草剂通常会对暴露于该除草剂的作物植株造成有害影响。克服这个问题的一个方法是产生能够耐受广谱除草剂的作物。广谱除草剂的一个实例是N-膦酰甲基甘氨酸，也称为草甘膦。草甘膦已经被全世界的农民广泛应用于在作物种植之前，例如在免耕种植(notillfarming)中，控制杂草。此外，草甘膦是一种用于在生长周期之间或作物轮作中控制杂草和自生植物(volunteerplant)的高效手段。草甘膦在使用后不会在土壤中遗留(carryover)，因此被认为是可用于农业的环境安全性最高的、广泛有效的化学除草剂之一。草甘膦通过抑制莽草酸途径杀死植物。这个途径导向芳族化合物(包括氨基酸、维生素和植物激素)的生物合成。草甘膦通过结合并抑制5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(通常被称作“EPSP合酶”和“EPSPS”)的活性，阻断磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与3-磷代莽草酸缩合形成5-烯醇式丙酮酰-3-磷代莽草酸。不幸的是，已知没有作物可以天然耐受草甘膦，因此，这种除草剂在栽培作物中控制杂草的用途受到了限制。一种产生耐草甘膦作物的方法是，使用基因工程技术将编码异源草甘膦耐受形式的EPSPS的基因导入到作物中。利用化学诱变，已经在细菌中产生了草甘膦耐受形式的EPSPS，并将该异源基因导入到了植物体内，产生了草甘膦耐受性植物。参见，例如Comaietal.(1983)Science221:37071。可在作物中过表达异源EPSPS基因以获得期望的耐受水平。EPSPS折叠成两个相似结构域，每个结构域包含三个拷贝的βαβαββ折叠单位(Stallingsetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:5046-50)。Lys-22、Arg-124、Asp-313、Arg-344、Arg-386、和Lys-411为来自大肠杆菌(E.coli)的EPSPS的保守残基(Schonbrunnetal.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:1376-80)。对于EPSPS活性重要的保守残基还包括Arg-100、Asp-242、以及Asp-384(Selvapandiyanetal.(1995)FEBSLetters374:253-6)。Arg-27结合S3P(Shuttleworthetal.(1999)Biochemistry38:296-302)。已分离了由于EPSPS氨基酸编码序列变化所导致的耐草甘膦的野生型EPSPS变体(Kishore和Shah(1988)Annu.Rev.Biochem.57:627-63；Wangetal.(2003)J.PlantRes.116:455-60；Eschenburgetal.(2002)Planta216:129-35)。Heetal.(2001)BiochimetBiophysicaActa1568:1-6)通过在大肠杆菌EPSPS基因与鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)EPSPS基因之间的诱变和重组，研发了具有增加的草甘膦耐受性的EPSPS酶，并提出在位置(T42M)和位置230(Q230K)处的突变很可能负责观察到的抗性。后续工作(Heetal.(2003)Biosci.Biotech.Biochem.67:1405-9)表明，T42M突变(苏氨酸到甲硫氨酸)足以提高大肠杆菌酶和鼠伤寒沙门菌酶两者的耐受性。目前，在本领域已知有三个主要类别的EPSPS：I类(草甘膦敏感的)；II类(PCT国际专利公开No.WO2006/012080A2；Liangetal.(2009)J.Biotechnol.144(4):330-6)；和III类(PCT国际专利公开No.WO2007/0082269A2；美国专利公开No.US2010/0144530A1)。前述关于相关技术及其相关局限性的实例只是说明性的，而不是排它性的。通过阅读本说明书，本领域的技术人员容易想到相关技术的其它局限性。公开本文描述了一类新的EPSPS酶，所述酶可以通过保守氨基酸序列基序(一级结构)以及二级结构元件和三级结构元件来识别。这些新的EPSPS酶在本文中称为“IV类”EPSPS酶。根据一些实施方案，可以如本文中例示地那样改变这些酶的结构，从而影响草甘膦在异源表达所述酶的细胞或生物中的代谢，以便例如提供在所述细胞或生物中的草甘膦耐受性。在特定的实施方案中，利用IV类EPSPS酶的保守结构元件来鉴定可对转基因生物(例如，植物)赋予草甘膦耐受性的其他EPSPS酶。因此，一些实施方案包括与选自下组的至少一种IV类EPSPS具有至少90％同一性的分离多肽：SEQIDNO:1、67、68、69、145、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、和168；和/或包含SEQIDNO:170-173的分离多肽。一些实施方案包括编码与选自下组的至少一种IV类EPSPS具有至少90％同一性的多肽的核酸：SEQIDNO:1、67、68、69、145、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、和168；和/或编码包含SEQIDNO:170-173的EPSPS酶的核酸。在一些实例中，编码与选自下组的至少一种IV类EPSPS具有至少90％同一性的多肽的核酸：SEQIDNO:1、67、68、69、145、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、和168，和/或编码包含SEQIDNO:170-173的EPSPS酶的核酸，包含与选自下组的至少一个核苷酸序列具有至少约80％同一性(例如，至少79％，至少80％，至少约81％，至少约82％，至少约83％，至少约84％，至少约85％，至少约86％，至少约87％，至少约88％，至少约89％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的核酸分子，其包含可操作连接的异源启动子与编码嵌合蛋白的的多核苷酸，所述嵌合多肽由：5‑烯醇式丙酮酰莽草酸‑3‑磷酸合成酶(EPSPS)多肽，和叶绿体转运肽(CTP)组成，其中所述EPSPS多肽包含与选自SEQ ID NO:1、67、68、76、77、78、145、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166和168的氨基酸序列中第一个甲硫氨酸之后的氨基酸相同的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
2012.02.01 US 61/593,555;2012.04.17 US 61/625,2221.一种分离的核酸分子，其包含可操作连接的异源启动子与编码嵌合蛋白的的多核苷酸，所述嵌合多肽由：5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)多肽，和叶绿体转运肽(CTP)组成，其中所述EPSPS多肽包含与选自SEQIDNO:1、67、68、76、77、78、145、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166和168的氨基酸序列中第一个甲硫氨酸之后的氨基酸相同的氨基酸序列。2.权利要求1的核酸分子，其中所述EPSPS多肽包含与选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO:76、SEQIDNO:77、SEQIDNO:78和SEQIDNO:145的氨基酸序列中第一个甲硫氨酸之后的氨基酸相同的氨基酸序列。3.权利要求2的核酸分子，其中所述EPSPS多肽由选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO:76、SEQIDNO:77、SEQIDNO:78和SEQIDNO:145的氨基酸序列组成。4.权利要求1的核酸分子，其中编码所述EPSPS多肽的多核苷酸的核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列具有至少80％同一性：SEQIDNO:2-24和144。5.权利要求4的核酸分子，其中编码所述EPSPS多肽的多核苷酸的核苷酸序列选自下组：SEQIDNO:2-24和144。6.权利要求2的核酸分子，其中CTP选自下组：SEQIDNO:176-184。7.权利要求6的核酸分子，其中编码所述CTP的多核苷酸的核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列至少80％相同：SEQIDNO:33-41...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·M·里拉，R·M·西奇洛，S·K·奈尔，
申请(专利权)人：陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：美国,US