一种重组褐藻胶裂解酶及其构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种重组褐藻胶裂解酶及其构建方法及应用，属于生物技术领域。本发明专利技术所涉及的褐藻胶裂解酶Aly‑Cob来源于环境样品(海带堆放处与工厂生产废料的混合物)，本发明专利技术利用基因工程的技术方法，将该褐藻胶裂解酶的基因克隆到表达载体上，获得可异源表达褐藻胶裂解酶的重组菌株，该菌株发酵产生的褐藻胶裂解酶Aly‑Cob，具有降解海藻酸钠制备褐藻寡糖的功能。本发明专利技术提供的褐藻胶裂解酶Aly‑Cob可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及海藻加工等领域。

Recombinant alginate lyase and construction method and application thereof

The invention discloses a recombinant alginate lyase and a construction method and application thereof, belonging to the field of biotechnology. The alginate lyase Aly Cob of the present invention is derived from the environmental sample (a mixture of the production waste of the kelp stacking and the factory production waste). The invention uses the technique of gene engineering to clone the gene of the alginate lyase on the expression vector and obtain a recombinant strain that can express the alginate lyase with a special source, and the strain is fermented. The alginate lyase Aly? Cob has the function of degrading alginate oligosaccharides. The alginate lyase Aly L Cob can be widely applied to agriculture, food, feed addition, medicine and seaweed processing.

【技术实现步骤摘要】
一种重组褐藻胶裂解酶及其构建方法及应用
本专利技术涉及一种重组褐藻胶裂解酶及其构建方法及应用，属于生物

技术介绍
近年来，随着海洋药物的蓬勃发展，海藻多糖的研究日益受到重视，褐藻胶便是其中之一。褐藻胶具有广泛的应用价值，褐藻胶降解物由于具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖血脂等多种生物活性，目前已成为国际上褐藻酸产品深入研发高附加值利用的代表方向和研究热点。褐藻胶裂解酶作为工具酶酶解生产褐藻寡糖和低分子量多糖具有降解条件温和，过程可控，得率高等优点，已逐渐取代传统酸解方法而成为褐藻寡糖生产的主要方式。此外，这类酶除了可以制备褐藻寡糖，还在诸多方面都具有重要的研究价值和应用价值，如活性海藻低聚糖的制备，原生质体的制备，肺囊性纤维化的辅助治疗等。因此，褐藻胶裂解酶的挖掘有广阔的前景。现已报道的褐藻胶裂解酶多是从海带、以褐藻为食的海洋动物和土壤中的微生物中获得，如交替假单胞菌(Pseudoaltermonaselyakovii)、假单胞菌(Pseudomonassp.QD03、Pseudomonasfluorescens、Pseudomonassyringae)、固氮菌(Azotobactervinelandii)、弧菌(Vibriosp.510–64、Vibriosp.O2)、克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)、芽胞杆菌(Bacillussp.ATB-1015)、黄杆菌(Flavobacteriumsp.LXA)、交替单胞菌(Alteromonassp.M-1)、棒杆菌(Corynebacteriumsp.ALY-1)、肠杆菌(Enterobacter-CloacaeM-1)、链霉菌(Streptomycessp.ALG-5)等。此外，在少数的病毒和噬菌体中也发现了褐藻胶裂解酶。大部分产酶微生物生长条件特殊，产酶量低，分离困难。目前已有超过20种褐藻胶裂解酶的基因得到克隆和测序，并构建出多种重组褐藻胶裂解酶基因工程菌，但重组褐藻胶裂解酶基因工程表达水平较低，限制了酶的应用。因此，利用基因工程手段，进一步获得高产褐藻胶裂解酶工程菌，将推动褐藻胶裂解酶的发展及其应用拓展。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种褐藻胶裂解酶Aly-Cob及其编码基因。本专利技术所提供的重组褐藻胶裂解酶Aly-Cob，通过构建Fosmid文库筛选得到，其氨基酸序列具有如下特征之一：1)序列表中SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-352或第30-352位氨基酸残基序列；2)对序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有褐藻胶裂解酶活性的氨基酸序列。本专利技术还提供了褐藻胶裂解酶Aly-Cob的编码基因(命名为aly-cob)，具有下述核苷酸序列特征之一：1)序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；2)编码序列表中SEQIDNO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；3)对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有褐藻胶裂解酶活性的核苷酸序列。本专利技术的重组褐藻胶裂解酶的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的Aly-Cob的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。本专利技术的第二个目的是提供含有所述的褐藻胶裂解酶基因的重组表达质粒和重组基因工程菌株。所述的重组表达质粒，是携带编码所述内切褐藻胶裂解酶的基因的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、谷氨酸棒杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。所述大肠杆菌表达载体，可以是pET-21a(+)、pET-28a(+)、pET-32a(+)。所述枯草杆菌表达载体可以是pMA5。所述酵母表达载体可以是pPIC3.5k。所述谷氨酸棒杆菌表达载体可以是pDXW-10。所述的重组基因工程菌株，是用于重组表达内切褐藻胶裂解酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞(如EscherichiacoliBL21、EscherichiacoliJM109、EscherichiacoliDH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如BacillussubtilisR25、Bacillussubtilis9920等)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum等)、放线菌宿主细胞(如Streptomycesspp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride，Trichodermareesei，Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori，Antharaeaeucalypti等)，哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO，幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)中的一种。具体地，所述重组基因工程菌株可以是E.coliBL21pLysS/pET-28a(+)-aly-cob。本专利技术的第三个目的是提供一种制备重组褐藻胶裂解酶Aly-Cob的方法，是将编码基因aly-cob克隆到表达载体，并导入宿主细胞，以获得重组褐藻胶裂解酶。例如，将构建好的重组菌E.coliBL21pLysS/pET-28a(+)-aly-cob接入液体LB中，37℃培养至OD600达0.8左右，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导后，收集发酵上清，并收集菌体进行破碎，离心留取上清后与发酵上清合并，经纯化可得到重组褐藻胶裂解酶。本专利技术采用构建Fosmid文库方法筛选得到一段褐藻胶裂解酶基因序列aly-cob，该基因编码区长1059bp，编码了352个氨基酸，其中1-29位氨基酸编码信号肽，30-352位氨基酸编码褐藻胶裂解酶，分子量约35kDa，属于多糖裂解酶7家族。本专利技术在大肠杆菌中异源表达获得的Aly-Cob，以海藻酸钠为底物时，在45℃、pH8.0的条件下具有最高酶活性，既可降解聚古罗糖醛酸(PG)又可以降解聚甘露糖醛酸(PM)，但对后者的特异性更强。液质分析表明，褐藻酸钠的降解产物主要为二、三、四糖，少量为五糖和六糖。该酶在1.5mol·L-1的NaCl和1mol·L-1的KCl条件下，酶活分别提高至原酶活的1.7和1.5倍。本专利技术提供的褐藻胶裂解酶Aly-Cob可单独或与其他来源褐藻胶降解酶，或其他种类酶共同使用，用于制备褐藻寡糖或对含有褐藻酸盐的高粘原料进行降粘处理。本专利技术的褐藻胶裂解酶可广泛用于化工、农业、食品和饲料添加、医药及海藻遗传工程等领域。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的Aly-Cob是一种极具潜力的重组褐藻胶裂解酶，其优点主要体现在：(1)构建的重组菌酶活水平高，产酶周期短；(2)Aly-Cob粗酶液中杂蛋白含量少，易于分离纯化；(3)Aly-Cob具有较好的热稳定性，以及pH与盐的耐受性，在工业应用中具有优势；(4)Aly-Cob可用于高效制备褐藻寡糖及进行含藻酸盐原料的降粘处理。附图说明图1：褐藻胶裂解酶基因a本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码褐藻胶裂解酶Aly‑Cob的基因，其特征在于，其核苷酸序列具有如下特征之一：1)具有SEQ ID NO.1所示的脱氧核糖核酸序列；2)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的脱氧核糖核酸序列；3)对SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有褐藻胶裂解酶活性的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种编码褐藻胶裂解酶Aly-Cob的基因，其特征在于，其核苷酸序列具有如下特征之一：1)具有SEQIDNO.1所示的脱氧核糖核酸序列；2)编码SEQIDNO.2所示氨基酸序列的脱氧核糖核酸序列；3)对SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有褐藻胶裂解酶活性的核苷酸序列。2.一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，具有如下特征之一：1)SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-352或第30-352位氨基酸残基序列；2)对SEQIDNO.2所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有褐藻胶裂解酶活性的氨基酸序列。3.一种制备权利要求2所述的褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将褐藻胶裂解酶基因克隆到表达载体中，得到重组质粒；(2)将重组质粒转化宿主菌，得到产褐藻胶裂解酶的基因工程菌。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、谷氨酸棒杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述宿主菌，是指包括EscherichiacoliBL21、EscherichiacoliJM109或EscherichiacoliDH5α在内的大肠杆菌宿主细胞、包括Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris或Kluyveromyceslac...

【专利技术属性】
技术研发人员：史劲松，许正宏，李恒，郝瑶，龚劲松，李会，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32