一种酯酶EstC11及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酯酶EstC11及其编码基因和应用。本发明专利技术从嗜热芽孢杆菌Bacillus sp.CX01中克隆得到酯酶基因EstC11，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长为717bp，其编码的酯酶EstC11共包含238个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将酯酶基因EstC11与表达载体pET‑28α(+)连接后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组酯酶EstC11。酯酶EstC11能催化酯类水解、酯化和/或转酯化反应，酯酶EstC11作为催化剂通过水解拆分(±)‑乙酸苏合香酯，可制备得到光学纯度为98％，得率为39％的R‑乙酸苏合香酯。

An esterase EstC11 and its encoding gene and Application

The present invention discloses an esterase EstC11 and its coding gene and application. The invention has cloned the esterase gene EstC11 from Bacillus thermophilus Bacillus sp.CX01, and its nucleotide sequence, as shown by SEQ ID NO.1, is 717bp, and its encoded esterase EstC11 contains 238 amino acids, and its amino acid sequence, such as SEQ ID NO.2, is shown. The esterase gene EstC11 was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) after the expression of pET (28) was added to the expression vector, and the recombinant esterase EstC11 was obtained after culture and induced expression. Esterase EstC11 can catalyze the hydrolysis, esterification and / or transesterification of esters. Esterase EstC11 can be used as a catalyst to hydrolyze (+) sodium acetate, acetic acid ester acetate, and the optical purity of 98%, and the yield of 39% of R, can be prepared.

【技术实现步骤摘要】
一种酯酶EstC11及其编码基因和应用
：本专利技术属于生物化工和生物
，具体涉及一种酯酶EstC11及其编码基因和应用。
技术介绍
：酯酶广泛存在于动物、植物及微生物中，是一类催化水解或形成酯键的酶，作用的底物通常是脂肪链小于十个碳原子的酯类。酯酶属于α/β折叠水解酶超家族，催化中心一般由丝氨酸、天冬氨酸/谷氨酸和组氨酸组成，保守序列为丝氨酸附近的五肽(GXSXG)序列。酯酶能催化水解、酯化、转酯化等多种化学反应，是一种很重要的工业生物催化剂，被广泛运用于精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织、废水处理和饲料工业等领域。从催化特性来看，酯酶具有高度的化学选择性和立体异构选择性，且反应不需要辅酶、反应条件温和、副产物少。在生产应用中的酯酶的另一显著特点是它能在异相系统(即油-水界面)或有机相中作用。在水相中，酯酶通常催化水解反应，而在有机相中，它却能催化酯化和转酯化反应。通过微生物酯酶的生物转化制备新型药物中间体或者去除药物消旋体中的非有效成分，是一种重要的手性技术，有着非常广阔的应用前景，它可以为合成手性药物提供新的平台，为大量制备光学纯化合物提供新的方法。酶法选择性拆分消旋体化合物，具有立体专一性高，副反应少，产率高，产物光学纯度好以及反应条件温和的优点，所以是一种被广泛认可的拆分方法。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种新的酯酶EstC11及其编码基因和应用。本专利技术从一株嗜热芽孢杆菌Bacillussp.CX01中开发得到一种酯酶EstC11及其编码基因EstC11，构建了含有酯酶基因EstC11的重组表达载体和基因工程菌，培养基因工程菌后获得酯酶EstC11，其可应用于拆分(±)-乙酸苏合香酯。本专利技术的第一个目的是提供一种酯酶EstC11，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第二个目的是提供一种编码所述的酯酶EstC11的酯酶基因EstC11。所述的酯酶基因EstC11的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供一种含有所述的酯酶基因EstC11的重组表达载体。所述的表达载体，优选pET-28α(+)载体。本专利技术还提供一种含有所述的酯酶基因EstC11的基因工程菌。所述的基因工程菌，优选大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)。本专利技术的第三个目的是提供所述的酯酶EstC11在催化酯类水解、酯化和/或转酯化反应中的应用。优选，所述的应用为酯酶EstC11在拆分(±)-乙酸苏合香酯制备得到R-乙酸苏合香酯中的应用。本专利技术的第四个目的是提供酯酶EstC11在耐受金属离子、表面活性剂或有机溶剂环境下进行催化的应用，所述的金属离子为Mg2+、Na+、Ca2+或Li+；所述的表面活性剂为三聚磷酸钠；所述的有机溶剂为正己烷或异辛烷。本专利技术的酯酶基因EstC11来自嗜热芽孢杆菌Bacillussp.CX01，保存在中国科学院南海海洋研究所。本专利技术利用生物信息学分析方法，分析得到一个酯酶基因EstC11。通过PCR的方法，从上述嗜热芽孢杆菌Bacillussp.CX01基因组中克隆得到酯酶基因EstC11，全长为717bp(从起始密码子到终止密码子)，编码238个氨基酸。将酯酶基因EstC11与表达载体pET-28α(+)连接后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组酯酶EstC11。酯酶EstC11能催化酯类水解、酯化和/或转酯化反应，酯酶EstC11作为催化剂拆分(±)-乙酸苏合香酯，可制备得到R-乙酸苏合香酯。附图说明：图1是酯酶EstC11的SDS-PAGE电泳；其中，M为蛋白marker，泳道1为IPTG诱导前的含有pET-28α(+)-EstC11的大肠杆菌BL21(DE3)总蛋白，泳道2为IPTG诱导后的含有pET-28α(+)-EstC11的大肠杆菌BL21(DE3)蛋白上清，泳道3为纯化的酯酶EstC11。图2是酯酶EstC11对不同侧链长度酰基的对硝基苯酚酯的特异性。图3是pH对酯酶EstC11活性的影响。图4是不同pH对酯酶EstC11稳定性的影响。图5是温度对酯酶EstC11活性的影响。图6是不同温度对酯酶EstC11稳定性的影响。图7是在酯酶EstC11作用下(±)-乙酸苏合香酯e.e.s和Y随反应pH的变化曲线。图8是在酯酶EstC11作用下(±)-乙酸苏合香酯e.e.s和Y随反应温度的变化曲线。图9是在酯酶EstC11作用下(±)-乙酸苏合香酯e.e.s和Y随底物浓度的变化曲线。图10是在酯酶EstC11作用下(±)-乙酸苏合香酯e.e.s和Y随酶量的变化曲线。图11是在酯酶EstC11作用下(±)-乙酸苏合香酯e.e.s和Y随反应时间的变化曲线。图12是反应前(±)-乙酸苏合香酯气相色谱图，S表示S-乙酸苏合香酯，R表示R-乙酸苏合香酯。图13是最适反应条件下酯酶EstC11对(±)-乙酸苏合香酯的选择性水解气相色谱图，S表示S-乙酸苏合香酯，R表示R-乙酸苏合香酯，S’表示S-1-苯乙醇，R’表示R-1-苯乙醇。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。本专利技术的酯酶基因EstC11来源于基因组测序的嗜热芽孢杆菌Bacillussp.CX01，该菌保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。实施例1：酯酶基因EstC11开放阅读框边界确定及引物设计提取嗜热芽孢杆菌Bacillussp.CX01的基因组DNA，经全基因组测序后，利用生物信息学手段对基因组进行基因注释，分析其中的酯酶基因，确定了其中酯酶基因EstC11的开放阅读框，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，全长为717bp(从起始密码子到终止密码子)，将其在NCBI中进行blastx比对分析，表明其与来源BacillusparalicheniformisMDJK30的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶(rhamnogalacturonanacetylesterase，WP_003180904.1)有96％的一致性。该鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶(共235个氨基酸)只在蛋白质数据库中进行了序列注释并未对其功能进行鉴定(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/WP_003180904.1)，并且目前没有发现对这个鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶的功能进行相应的鉴定和在手性拆分中的应用的报道。酯酶基因EstC11编码的酯酶EstC11的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，共238个氨基酸。根据分析得到的酯酶基因EstC11序列，设计全长扩增引物如下：上游引物：5′-CACGGATCCATGAAACGAACAGACAAAAAGCC-3′(下划线为BamHI酶切位点)；下游引物：5′-CATCTCGAGTTACACGCCGGCACGGAA-3′(下划线为XhoI酶切位点)。实施例2：酯酶基因EstC11的克隆及载体构建2.1PCR扩增将实施例1设计的引物(上游引物：5′-CACGGATCCATGAAACGAACAGACAAAAAGCC-3′；下游引物：5′-CATCTCGAGTTACACGCCGGCACGGAA-3′)送至上海生物工程有限公司合成，合成的引物使用TE缓冲液溶解成终浓度为10μM，以提取的嗜热芽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酯酶EstC11，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种酯酶EstC11，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一种编码权利要求1所述的酯酶EstC11的酯酶基因EstC11。3.根据权利要求2所述的酯酶基因EstC11，其特征在于，所述的酯酶基因EstC11的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.一种含有权利要求2所述的酯酶基因EstC11的重组表达载体。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pET-28α(+)载体。6.一种含有权利要求2所述的酯酶基因EstC11的基因工程菌。7.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡云峰，公颜慧，马三梅，王永飞，张继福，张云，孙爱君，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44