一种提高变色栓菌（Trametes versicolor）漆酶产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高变色栓菌(Trametes versicolor)漆酶产量的方法，在变色栓菌漆酶发酵过程中对菌体进行超声处理并继续发酵以产生漆酶。通过在发酵过程中直接对摇瓶中的菌体进行超声处理，操作简单且减少污染的可能；菌丝生长阶段，采用较高强度的超声使该菌菌丝体出现超支化菌丝形态和球茎状顶部以增加分泌位点的面积，改善细胞膜通透性以加速漆酶的分泌，产酶阶段，采用较低强度超声可以诱导生成活性氧类物质以刺激漆酶基因的表达，从而有效地提高变色栓菌的漆酶产量。实验证明，采用本发明专利技术的方法漆酶产量可以提高3倍以上，最大可提高5‑6倍。本发明专利技术的方法操作简单，易于放大生产，适于大规模漆酶发酵，从而降低漆酶生产成本，满足规模化应用的要求。

A method to increase laccase production of Trametes versicolor

The invention discloses a method for improving the production of Trametes versicolor laccase, which is processed by ultrasonic treatment and fermentation to produce laccase in the fermentation process of the chameleon laccase. By ultrasonic treatment of the bacteria in the shake flask in the process of fermentation, the operation is simple and the pollution may be reduced. In the growth stage of the mycelia, the hypha form and the corm like top of the mycelium are produced by high intensity ultrasound to increase the area of the secretory site, and improve the permeability of the cell membrane to accelerate laccase. The production of laccase gene can be stimulated by low intensity ultrasound to stimulate the expression of laccase gene, which can effectively improve the laccase production of chameleon. The experiment proves that the yield of laccase can be increased by more than 3 times and the maximum can be increased by 5 to 6 times by using the method. The method of the invention is simple in operation, easy to enlarge production, suitable for large-scale laccase fermentation, thereby reducing the production cost of laccase, and meeting the requirements of large-scale application.

【技术实现步骤摘要】
一种提高变色栓菌(Trametesversicolor)漆酶产量的方法
本专利技术涉及生物工程
，具体为一种提高变色栓菌(Trametesversicolor)漆酶产量的方法。
技术介绍
漆酶(laccase,EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，通过获得氧气催化多种酚类化合物，使之生成对应的苯醌和水。在自然界中，漆酶主要存在于植物、真菌，以及少数的昆虫和细菌中.变色栓菌作为生产漆酶公认的优良菌株之一，是主要的漆酶“生产者”。近年来漆酶因其在工业方面的应用受到越来越多的关注，例如废水处理、生物修复、纸浆的漂白、生物传感器的建立和食品加工等。但是，漆酶发酵表达水平低成为其生产和应用成本高的原因之一。因此，提高漆酶产量，降低其生产成本成为现阶段漆酶研究热点之一。目前，有关提高漆酶产量的研究大都集中于菌株培养基及发酵条件的优化，但此方法工作量大，效率低且漆酶产量的提高是有限的。除此之外，共培养、使用生物表面活性剂及诱导剂等方法也成为提高漆酶产量的常用方法。然而，虽然上述方法对漆酶产量有一定的提高，但对于漆酶的商业化应用而言，其幅度是远远不够的，因此如何大幅度提高漆酶产量依然是研究的重点。超声是生物细胞培养过程强化的有效手段之一，超声强化可以改善反应体系的传质，超声无论是在多相还是均相反应体系中都可以改善传质和提高反应速率；超声促进生长和次级代谢产物合成，其在生物细胞培养的过程中可以作为一种提高生物量和次生代谢产物产量的一种方式；超声破坏细胞促进胞内产物释放，高强度的超声能够对细胞造成损伤，破坏细胞，使其胞内产物释放；超声反应器在还能作为生物反应器在细胞培养中应用。研究者采用超声强化的手段能够加快水华鱼腥藻(Anabaenaflos-aquae)的生长速率，且生物量增加46％(Franck等人,Effectoflow-doseultrasonictreatmentonphysiologicalvariablesinAnabaenaflos-aquaeandSelenastrumcapricornutum,1990,12:219-224)。此外，超声能促进人参(Panaxginseng)细胞膜的离子通量，提高其次生代谢产物的产量(Wu等人,Elicitor-likeeffectsoflow-energyultrasoundonplant(Panaxginseng)cells:Inductionofplantdefenseresponseandsecondarymetaboliteproduction,2002,59:51-57)。然而，研究者对于超声的生物学效应研究较少，其生物学效应的理论机制不明确。本专利技术的专利技术人团队经过前期的大量研究，发现了超声对丝状真菌细胞生长和代谢调节的生理机制；在此基础上，本专利技术将超声强化引入变色栓菌游离菌丝体的漆酶发酵过程，以期能够通过生长阶段高频超声获得超支化菌丝形态以增加蛋白分泌位点和产酶阶段低频超声提高漆酶基因表达水平的耦合策略，改善丝状真菌变色栓菌的产酶能力，大幅提高变色栓菌的胞外漆酶的表达水平，为降低漆酶生产成本提供一种有效的途径，同时也为其它丝状真菌产胞外蛋白的发酵系统提供一种高效的增产策略。
技术实现思路
本专利技术提供一种提高变色栓菌产漆酶能力的方法。该方法能够大幅提高变色栓菌的漆酶产量；并且该方法操作简单，易于放大生产。为实现本专利技术的目的，本专利技术提供以下技术方案：一种提高变色栓菌(Trametesversicolor)漆酶产量的方法，所述方法包括：在变色栓菌漆酶发酵过程中对菌体进行超声处理并继续发酵以产生漆酶。优选地，分别在6～48h的菌丝生长阶段和60～120h的产酶阶段进行超声处理。具体包括如下步骤：(1)将预培养的变色栓菌菌丝体接种到漆酶发酵培养基中，进行发酵培养；(2)在发酵的第6～48h以频率40～80kHz，功率30～210w，总时间2～20min，工作间隔2～30s，次数1～4次对菌丝体进行超声处理；(3)在在发酵的第60～120h以频率10～30kHz，功率30～180w，总时间2～20min，工作间隔5～30s，次数1～5次对菌丝体进行超声处理；(4)超声后继续培养至发酵液中漆酶活力达到峰值时，结束发酵并收集发酵液。优选地所述步骤(1)中所述变色栓菌菌丝体预培养方法、发酵培养基的组成采用已有文献报道的方法(Wang等人,Ultrasound-intensifiedlaccaseproductionfromTrametesversicolor,UltrasonicsSon℃hemistry,2013,20:118–124)，培养温度26℃。进一步地，在发酵的第6～48h超声处理的频率为40～80kHz，功率为30～210w，总时间为2～20min。优选地，频率可以为0kHz、50kHz、60kHz、70kHz、80kHz，优选为30～70kHz，更优选为45～60kHz。优选地，超声处理的功率为30w、60w、90w、120w、150w、180w、210w，优选为60～180w，更优选为60～150w。优选地，超声处理的总时间为2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min，优选为3～15min，更优选为5～10min。进一步地，在发酵的第6～48h超声处理的工作间隔为5～30s。优选地，工作间隔为5s、10s、15s、20s、25s、30s，优选为5～20s，更优选为5～15s。进一步地，在发酵的第6～48h超声处理的次数为1～4次,每次超声处理间的时间均分。具体可以为1次、2次、3次、4次。进一步进一步的，在发酵的第60～120h超声处理的频率10～30kHz，功率为30～180w，超声处理的总时间为2～20min。优选地，频率为10kHz、15kHz、20kHz、28kHz、30kHz，优选为15～30kHz，更优选为20～30kHz。优选地，超声处理的功率为30w、60w、90w、120w、150w、180w，优选为60～150w，更优选为60～120w。优选地，超声处理的总时间为2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min，优选为3～10min，更优选为4～6min。进一步地，在发酵的第60～120h超声处理的工作间隔为5～30s。例如5s、10s、15s、20s、25s、30s，优选为5～20s，更优选为5～15s。进一步地，在发酵的第60～120h超声处理的次数为1～5次，每次超声处理间的时间均分。例如1次、2次、3次、4次、5次，优选为2～4次，更优选为2～3次，每次超声处理间的时间均分。本专利技术提供的提高变色栓菌漆酶产量的方法，是在发酵过程中直接对摇瓶中的菌体进行超声处理，操作简单且减少污染的可能；菌丝生长阶段，采用较高强度的超声使该菌菌丝体出现超支化菌丝形态和球茎状顶部以增加分泌位点的面积，改本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高变色栓菌(Trametes versicolor)漆酶产量的方法，其特征在于，所述方法包括：在变色栓菌漆酶发酵过程中对菌体进行超声处理并继续发酵以产生漆酶。

【技术特征摘要】
1.一种提高变色栓菌(Trametesversicolor)漆酶产量的方法，其特征在于，所述方法包括：在变色栓菌漆酶发酵过程中对菌体进行超声处理并继续发酵以产生漆酶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分别在发酵的第6～48h和发酵的第60～120h进行超声处理。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在发酵的第6～48h超声处理的频率为40～80kHz，功率为30～210w，总时间为2～20min。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，在发酵的第6～48h超声处理的工作间隔为5～30s。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在发酵的第6～48h超声处理的次数为1～4次,每次超声处理间的时间均分。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在发酵的第60～120h超声处理的频率10～30kHz，功率为30～180w，超声处...

【专利技术属性】
技术研发人员：王锋，徐玲，马海乐，孙柯，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32