一种稳定产生人内源性Ito，s电流的细胞模型及构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种稳定产生人内源性Ito，s电流的细胞模型，包括一个稳定表达dCas9‑VP64融合蛋白的宿主细胞，在所述的宿主细胞中含有KCNA4基因特异性的引导序列KCNA4‑gRNA。本发明专利技术还提供了上述细胞模型的构建方法：以稳定表达转录激活的效应分子dCas9‑VP64融合蛋白的HEK293细胞为宿主细胞，筛选有效的KCNA4特异性引导序列KCNA4‑gRNA，将有效KCNA4‑gRNA序列包装成病毒，感染宿主细胞并筛选阳性克隆，通过在KCNA4启动子区域转录激活内源性人KCNA4基因，增加其蛋白Kv1.4表达，得到稳定表达人内源性Ito，s的细胞模型。

A cell model for stable generation of human endogenous Ito and s currents and its construction method and Application

The present invention provides a cell model that produces a stable human endogenous Ito, s current, including a host cell that stably expresses the dCas9 VP64 fusion protein, and contains the KCNA4 gene specific guided sequence KCNA4 gRNA in the host cell. The invention also provides a method for the construction of the above cell model: the HEK293 cells that express the activated VP64 fusion protein HEK293 cells are the host cells, and the effective KCNA4 specific guided sequence KCNA4 gRNA is screened, the effective KCNA4 gRNA sequence is packaged into the virus, the host cells are infected and the positive clones are screened. The endogenous human KCNA4 gene was activated by transcription in the promoter region of KCNA4, and the expression of protein Kv1.4 was increased, and the cell model of human endogenous Ito and s was expressed steadily.

【技术实现步骤摘要】
一种稳定产生人内源性Ito，s电流的细胞模型及构建方法与应用
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种体外高通量药物筛选的细胞模型，具体来说是一种稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型及建立方法与应用。
技术介绍
离子通道是细胞膜上的孔道蛋白，是细胞生物电的基础。在离子通道中，钾离子通道是目前发现的亚型最多、功能最复杂的一类离子通道。电压依赖性钾通道(Kv)是钾离子通道超家族的重要成员，在调节动作电位阈值、形状、持续时间和频率及心肌细胞兴奋性、维持心肌细胞正常生理功能中起关键作用。Kv1.4属于电压依赖性钾通道，广泛分布于哺乳动物的可兴奋组织中(如心脏和大脑)，编码瞬时外向钾电流(Ito)。瞬时外向钾电流参与心肌细胞动作电位的复极1期。研究表明，Ito的密度及其通道动力学特征的改变与多种心脏疾病的发生密切相关，如J波综合征、心肌梗死、心力衰竭、心房颤动、心肌肥厚等。目前发现的Ito主要有Ito(fast，f)和Ito(slow，s)两种，Ito，f主要由Kv4.2和Kv4.3通道编码，激活快，失活也快，主要分布于心外膜，Ito，s主要由Kv1.4编码，其失活和恢复均相对较慢，主要分布于心内膜，Kv1.4表达增加可引起心肌肥大和心力衰竭，因此深入研究Ito,s通道特性、药理特性及其调节机制将可能为此类心律失常的防治提供新线索。电生理方法筛选阳性的离子通道克隆以及进行药物筛选，是检测离子通道是否在细胞表面表达且发挥功能的标准方法。利用膜片钳技术记录透过离子通道的离子电流来反映细胞膜上离子通道的分子活动，能够很好的研究细胞表面离子通道的作用，广泛应用于药物化合物的筛选。HEK293细胞是来源于人胚肾细胞的细胞系，其转染效率高，胞体大，广泛应用于细胞电生理的研究。目前利用人源性细胞进行药物的高通量筛选存在以下问题：1)人的组织样本来源困难、个体差异大；2)人源性的原代细胞难于维持培养；3)建系的人源性过表达离子通道蛋白的细胞系，没有经过内源性的基因剪接，缺乏内源性的“转录-翻译”过程；4)外源过表达质粒形成的通道电流变异度高，无法进行高通量筛选。因此，需要建立体外稳定表达的人内源性细胞模型，助力药物的稳定高效筛选。
技术实现思路
针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型及建立方法与应用，所述的这种稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型及建立方法与应用要解决现有技术中难以利用人源性细胞进行高通量筛选药物的技术问题。本专利技术提供了一种稳定产生人内源性Ito，s电流的细胞模型，包括一个稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的宿主细胞，编码所述dCas9-VP64融合蛋白的基因序列如SEQIDNO.1所示，在所述的宿主细胞中含有KCNA4基因特异性的引导序列KCNA4-gRNA，所述的含有KCNA4基因特异性的引导序列KCNA4-gRNA的基因序列如SEQIDNO.5所示。进一步的，所述的宿主细胞为HEK293细胞。本专利技术还提供了上述的一种稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型的构建方法，先构建gRNA通用载体，然后再构建KCNA4靶向gRNA载体；筛选含有有效KCNA4-gRNA序列的载体，所述的含有KCNA4基因特异性的引导序列KCNA4-gRNA的基因序列如SEQIDNO.5所示；将有效的KCNA4-gRNA载体包装成慢病毒；将上述的慢病毒感染已稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的宿主细胞并筛选阳性克隆，编码所述的dCas9-VP64融合蛋白基因序列如SEQIDNO.1所示，获得稳定表达人内源性KCNA4的细胞模型。进一步的，首先构建稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的宿主细胞，其方法为：将dCas9-VP64序列构建到载体上，然后包装成慢病毒，感染HEK293细胞，最后筛选阳性克隆，即得稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的宿主细胞。进一步的，建立稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的HEK293细胞株的步骤包括：(1)全基因合成dCas9-VP64基因序列，所述的dCas9-VP64基因序列如SEQIDNO.1所示，将dCas9-VP64序列插入到pLVX-Puro载体的XhoI和EcoRI之间，构建pLVX-dCas9-VP64-Puro载体；(2)将pLVX-dCas9-VP64-Puro载体包装成慢病毒；(3)使用慢病毒感染HEK293细胞，用嘌呤霉素筛选出阳性克隆。进一步的，所述载体为pLVX-Puro、慢病毒包装质粒pCMV-dR8.91和慢病毒包装质粒pCMV-VSV-G。进一步的，将KCNA4-gRNA连接到载体上的步骤包括：(1)全基因合成gRNA通用载体序列，所述的gRNA通用载体序列如SEQIDNO.4所示，将所述的gRNA通用载体序列插入到pLVX-shRNA2载体的BamHI和EcoRI之间，构建pLVX-U6-BsmBI-gRNA-Zsgreen1载体；(2)将候选的KCNA4-gRNA序列插入到pLVX-U6-BsmBI-gRNA-Zsgreen1载体，所述的KCNA4-gRNA的基因序列如SEQIDNO.5所示；获得pLVX-U6-KCNA4-gRNA-Zsgreen1载体。进一步的，将包含有效KCNA4-gRNA序列的载体包装成慢病毒，感染HEK293-dCas9-VP64宿主细胞的步骤包括：1)将pLVX-U6-KCNA4-gRNA-Zsgreen1载体包装成慢病毒；2)使用慢病毒感染HEK293-dCas9-VP64宿主细胞，并用绿色荧光蛋白Zsgreen1筛选出阳性克隆。本专利技术还提供了上述的稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型在体外药物高通量筛选中的应用。进一步的，所述药物包括治疗心律失常的药物。本专利技术的核心在于一种激活人内源性基因KCNA4的表达，激活内源性KCNA4后，该细胞能够产生Ito,s电流，它有利于药物的高效筛选。本专利技术以稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的HEK293细胞为宿主细胞，筛选有效的KCNA4基因的引导序列，激活内源性KCNA4mRNA的表达，增加Kv1.4蛋白表达，从而产生Ito,s电流。本专利技术和已有技术相比，其技术进步是显著的。本专利技术通过将转录激活的效应分子dCas9-VP64和KCNA4基因特异性的引导序列KCNA4-gRNA共同转到HEK293细胞中，在KCNA4启动子区域转录激活内源性人KCNA4基因，增加Kv1.4蛋白表达，产生Ito，s电流，在缺乏内源性Ito，s的细胞中激活内源性KCNA4基因表达从而产生Ito，s电流，为进行体外药物筛选带来了许多便利。本专利技术在HEK293-dCas9-VP64细胞株基础上，利用慢病毒感染有效的KCNA4-gRNA在HEK293细胞中稳定的产生Ito，s电流，建立了体外稳定表达KCNA4的细胞模型，成功建立了人源性细胞的筛选平台，有利于临床药物筛选。本专利技术通过建立gRNA通用载体，为引入其他特异性引导RNA，建立其他基因的内源性表达提供了基础。本专利技术通过检测Zsgreen1绿色荧光，能够快速、高效地筛选内源性激活的阳性克隆，为电生理实验提供更有针对性的克隆“候选者”，从而节省了大量的时间和人力。附图说明图1是dCas9-VP64载体和KC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种稳定产生人内源性Ito，s电流的细胞模型，其特征在于：包括一个稳定表达dCas9‑VP64融合蛋白的宿主细胞，编码所述dCas9‑VP64融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示，在所述的宿主细胞中含有KCNA4基因特异性的引导序列KCNA4‑gRNA，所述的含有KCNA4基因特异性的引导序列KCNA4‑gRNA的基因序列如SEQ ID NO.5所示。

【技术特征摘要】
1.一种稳定产生人内源性Ito，s电流的细胞模型，其特征在于：包括一个稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的宿主细胞，编码所述dCas9-VP64融合蛋白的基因序列如SEQIDNO.1所示，在所述的宿主细胞中含有KCNA4基因特异性的引导序列KCNA4-gRNA，所述的含有KCNA4基因特异性的引导序列KCNA4-gRNA的基因序列如SEQIDNO.5所示。2.根据权利要求1所述的一种稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型，其特征在于：所述的宿主细胞为HEK293细胞。3.权利要求1所述的一种稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型的构建方法，其特征在于：先构建gRNA通用载体，然后再构建KCNA4靶向gRNA载体；筛选含有有效KCNA4-gRNA序列的载体，所述的含有KCNA4基因特异性的引导序列KCNA4-gRNA的基因序列如SEQIDNO.5所示；将有效的KCNA4-gRNA载体包装成慢病毒；将上述的慢病毒感染已稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的宿主细胞并筛选阳性克隆，编码所述的dCas9-VP64融合蛋白基因序列如SEQIDNO.1所示，获得稳定表达人内源性KCNA4的细胞模型。4.根据权利要求3所述的一种稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型的构建方法，其特征在于：首先构建稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的宿主细胞，其方法为：将dCas9-VP64序列构建到载体上，然后包装成慢病毒，感染HEK293细胞，最后筛选阳性克隆，即得稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的宿主细胞。5.根据权利要求4所述的一种稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型的构建方法，其特征在于：建立稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的HEK293细胞株的步骤包括：(1)全基因合成dCas9-VP64基因序列，所述的dCas9-VP64基因序列如SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈义汉，徐亮，高雪婷，俞帅，石蕊，管溢，
申请(专利权)人：上海市东方医院，
类型：发明
国别省市：上海,31