本发明专利技术公开了一种Luc‑GFP标记的高转移性人肝癌细胞株，是以肝癌细胞为母细胞，通过慢病毒转染包装有pCDH‑CMV‑Luc‑EF1‑GFP‑Puro的病毒液，再经嘌呤霉素筛选，获得稳定表达GFP并具有荧光素酶活性的高转移性人肝癌细胞株。利用本发明专利技术Luc‑GFP标记的高转移性人肝癌细胞，通过细胞悬液法和肿瘤组织块转接法分别建立裸鼠原位肝癌模型，其肝癌模型成瘤率均为100%，肺转移率分别100%和80%，为活体动物水平监控肿瘤的生长、评价抗肝癌转移药物的疗效奠定基础，具有较大的应用前景。
Luc-GFP labeled highly metastatic human hepatocellular carcinoma cell line and its application in orthotopic liver cancer models
The present invention discloses a highly metastatic human hepatocellular carcinoma cell line labeled with Luc GFP, which is a hepatoma cell as mother cell and transfected by lentivirus transfected with pCDH CMV Luc EF1 GFP Puro virus, and then screened by purinomycin to obtain a high metastatic human hepatoma cell line with stable expression of GFP and the activity of fluorescein. The liver cancer cells in situ in nude mice were established by cell suspension method and tumor tissue block transfer by using the Luc GFP marker of the present invention. The tumor formation rate of the liver cancer model was 100% and the lung metastasis rate was 100% and 80% respectively. It lays the foundation and has a great application prospect.
【技术实现步骤摘要】
Luc-GFP标记的高转移性人肝癌细胞株及其在原位肝癌模型中的应用
本专利技术属于生物医学领域，更具体地，涉及一种Luc-GFP标记的高转移性人肝癌细胞系及其在原位肝癌模型中的应用。
技术介绍
原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC，简称肝癌)是全球发病率占第六位、死亡率占第三位的恶性肿瘤。我国是肝癌的高发国，每年新发肝癌约35万例，每年死于肝癌的人数约32万人，已上升至城市和农村恶性肿瘤病死率的第二和第一位。肝癌侵袭转移与复发是患者死亡的主要原因之一。因此，探索肝癌侵袭转移与复发的机制，寻求有效抑制肝癌转移与复发的药物具有重要意义，而建立自发转移且观察方便的人肝癌裸鼠模型是研究人肝癌的复发与转移规律、评价抗肝癌药物疗效的基础。复旦大学肝癌研究所已建立了高转移人肝癌细胞系MHCC97H、HCCLM3以及高转移人肝细胞癌裸鼠模型等、为肝癌治疗、转移复发研究提供了有效的手段，但这些模型不能连续、直观地观察原位肿瘤及肺和腹腔转移灶，定量也不够准确。活体成像技术利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。活体成像技术主要采用荧光(fluorescence)与生物发光(bioluminescence)两种技术。荧光发光采用荧光报告基团(GFP、RFP、Cyt及dyes等)进行标记，需要激发光使得荧光基团达到较高的能量水平，然后发射出较长波长的发射光，但是生物体内很多物质在受到激发光激发后，也会发出荧光，产生的非特异性荧光。荧光发光不需要底物，费用低廉，操作简单。生物发光是将荧光素酶(Luciferase)基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，在ATP及氧气存在时，外源(腹腔或静脉注射)给予底物荧光素(Fluorescein)，荧光素酶催化荧光素的氧化反应产生发光。作为体内报告源，生物发光在动物体自身不会发光，具有极低的背景。申请公布号为CN102399748A的专利公开了一种表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株，通过将多种慢病毒包装质粒pWPT-GFP，pMD2.G，pSPAX2，pLenti-CMV-puro-LUC，VSVg和pCMV-dR8.91按照一定比例用脂质体法转染293T细胞，经过两次转染，获得含有绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶慢病毒颗粒，再以人胃癌细胞系为母细胞，用上述病毒感染，获得稳定表达绿色荧光蛋白和荧光素酶的阳性克隆；所述方法需要用到多种慢病毒包装质粒，且各个质粒需要按照一定比例要求，需要经过两次转染，不仅步骤繁琐，费时费力，而且转染效率不高，有一定的局限性。同时，转染载体的构建也影响着转染结果，病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞，此外还需考虑一些安全问题(如基因污染)。除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响。如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成或可调控，强度合适的启动子也很重要。目前还没有见有成功构建稳定表达荧光素酶(Luc)和绿色荧光蛋白(GFP)的人肝癌细胞株的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，通过一步转染法，首先构建稳定表达荧光素酶(Luc)和绿色荧光蛋白(GFP)的人肝癌细胞株HCCLM3-Luc-GFP，采用肝内细胞悬液移植法和肿瘤组织块移植法建立Luc-GFP标记的高转移性人肝癌细胞裸鼠原位肝癌模型，通过非侵袭性的生物发光成像技术(bioluminescencetomography)和激发荧光成像技术(fluorescencemoleculartomography)在活体水平观察两种方法建立的裸鼠原位肝癌模型肿瘤生长和转移情况，为活体动物水平监控肿瘤的生长、评价治疗效果以及肿瘤的转移分析提供了一种新的有用工具。本专利技术的目的是提供一种Luc-GFP标记的高转移性人肝癌细胞株。本专利技术的第二个目的是提供所述Luc-GFP标记的高转移性人肝癌细胞株在原位肝癌模型中的应用。本专利技术的上述目的通过以下技术方案给予实现：Luc-GFP标记的高转移性肝癌细胞株，其特征在于，是以肝癌细胞为母细胞，通过慢病毒转染包装有pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro的病毒液，再经嘌呤霉素筛选，获得稳定表达GFP并具有荧光素酶活性的高转移性人肝癌细胞株。优选地，所述pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro是以psiCHECK-2载体为模版，扩增Luc基因，再将Luc基因重组连接到pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro载体上构建而得；所述Luc基因的序列如SEQIDNO：3所示。优选地，所述Luc基因的PCR扩增引物包括上下游引物，其序列依次如SEQIDNO：1～2所示。优选地，在慢病毒转染过程中加入终浓度为4～8μg/mL聚凝胺，一定浓度的聚凝胺可提高转染效率，但是需要考虑其剂量对细胞的毒性。优选地，所述病毒液的MOL为8～12。优选地，是先将肝癌细胞株培养于含10％FBS的MEM培养基中，再取状态良好的对数生长期肝癌细胞按5×104cell/孔接种于24孔板中，过夜培养后进行慢病毒转染；健康的细胞培养物是成功转染的基础，不同细胞有不同的培养基，血清和添加物，本专利技术研究发现含10％FBS的MEM培养基对肝癌细胞的培养最为适宜，另外，高的转染效率需要一定的细胞密度。优选地，所述肝癌细胞株为人肝癌细胞株。更优选地，所述人肝癌细胞株为高转移性人肝癌细胞HCCLM3。本专利技术还请求保护所述Luc-GFP标记的高转移性肝癌细胞株在构建原位肝癌模型中的应用；以及所述Luc-GFP标记的高转移性肝癌细胞株在筛选或评估治疗肝癌药物中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过慢病毒转染包装有pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro的病毒液，再经嘌呤霉素筛选，只需一次转染就获得稳定表达GFP并具有荧光素酶活性的高转移性人肝癌细胞株。利用本专利技术Luc-GFP标记的高转移性人肝癌细胞，通过细胞悬液法和肿瘤组织块转接法分别建立裸鼠原位肝癌模型，其肝癌模型成瘤率均为100％，肺转移率分别100％和80％，为活体动物水平监控肿瘤的生长、评价抗肝癌转移药物的疗效奠定基础，具有较大的应用前景。附图说明图1为PCR扩增Luc基因电泳图；M：200bpDNALadder，1～4：P1、P2为引物扩增的Luc基因片段。图2为重组表达载体酶切鉴定图；M1：200bpDNALadder，M2：DL10000DNAMarker，1～4：pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro质粒、XbaⅠ单酶切、BamHI单酶切、XbaⅠ和BamHI双酶切。图3为慢病毒转染后荧光显微镜检测；A：白光，B：荧光。图4为未转染细胞荧光显微镜检测；A：白光，B：荧光。图5为肝癌细胞悬液法原位移植瘤的手术过程。图6为肝癌肿瘤组织块法原位移植瘤的手术过程。图7为细胞悬液接种法的活体荧光成像。图8为肿瘤组织块法的活体荧光成像。图9为肝脏肿瘤和肺转移灶实体观察；A为细胞悬液法肿瘤块均匀分布于肝脏，B为肿瘤组本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.Luc‑GFP标记的高转移性肝癌细胞株，其特征在于，是以肝癌细胞为母细胞，通过慢病毒转染包装有pCDH‑CMV‑Luc‑EF1‑GFP‑Puro的病毒液，再经嘌呤霉素筛选，获得稳定表达GFP并具有荧光素酶活性的高转移性人肝癌细胞株。
【技术特征摘要】
1.Luc-GFP标记的高转移性肝癌细胞株，其特征在于，是以肝癌细胞为母细胞，通过慢病毒转染包装有pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro的病毒液，再经嘌呤霉素筛选，获得稳定表达GFP并具有荧光素酶活性的高转移性人肝癌细胞株。2.根据权利要求1所述的Luc-GFP标记的高转移性肝癌细胞株，其特征在于，所述pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro是以psiCHECK-2载体为模版，扩增Luc基因，再将Luc基因重组连接到pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro载体上构建而得。3.根据权利要求2所述的Luc-GFP标记的高转移性肝癌细胞株，其特征在于，Luc基因的PCR扩增引物包括上下游引物，其序列依次如SEQIDNO：1～2所示。4.根据权利要求1所述的Luc-GFP标记的高转移性肝癌细胞株，其特征在于，在慢病毒转染过程中加入终浓度为4～8...
【专利技术属性】
技术研发人员：马艳，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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