一种内皮祖细胞的制备方法技术

技术编号:18455639 阅读:32 留言:0更新日期:2018-07-18 11:30
本发明专利技术属于生物技术领域,尤其涉及一种内皮祖细胞的制备方法。本发明专利技术提供了一种内皮祖细胞的制备方法,包括:a)将脐血进行分离,得到单个核细胞;b)将所述单个核细胞进行细胞培养,得到扩增细胞;c)将所述扩增细胞进行分选,得到内皮祖细胞,在培养体系中将所述内皮祖细胞进行扩增。实验结果表明,本发明专利技术制备方法能够在短时间内获得数量充足的内皮祖细胞,获得的内皮祖细胞纯度高、活力好、不容易出现分化。

Preparation of an endothelial progenitor cell

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a preparation method of endothelial progenitor cells. The present invention provides a preparation method of endothelial progenitor cells, including: a) separating umbilical blood, obtaining mononuclear cells; b) cell culture of the mononuclear cells, amplification cells; c) the amplified cells are selected, the endothelial progenitor cells are obtained, and the endothelial progenitor cells are expanded in the culture system. Increase. The experimental results show that the preparation method can obtain a sufficient number of endothelial progenitor cells in a short time. The obtained endothelial progenitor cells have high purity, good vitality and are not easy to differentiate.

【技术实现步骤摘要】
一种内皮祖细胞的制备方法
本专利技术属于生物
,尤其涉及一种内皮祖细胞的制备方法。本申请要求2018年1月23日提交的中国专利(专利申请号为201810064126.3)的权益,在此将上述申请的全部内容引用并入本文。
技术介绍
内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)不仅存在于胚胎发育阶段,也存在于成体。内皮祖细胞的来源有外周血、骨髓、脐血,其中脐血中内皮组组细胞含量比外周血高,并且脐血获取内皮组祖细胞具有无损伤性,是较理想的内皮组祖细胞来源。内皮祖细胞在维持血管壁的完整性、调节微血管通透性和血液的流动性等方面具有重要作用。内皮祖细胞分化功能丧失,可能引起血栓形成、动脉粥样硬化及脏器、组织水肿。建立血管内皮组祖细胞系能够为体外研究血管形成提供重要的研究载体。内皮祖细胞在体内受机体调控,迅速形成新的血管,极大的提高移植脂肪的存活率,是体外美容整形兴起的生物材料。目前获取内皮祖细胞的主要方法为Ficoll分离法,但是该分离方法获取的细胞种类多,不能有效的获得纯度较高的细胞。此外,获得的细胞在原代培养时,细胞增殖速度较慢,培养周期长,细胞在体外培养过程中,容易出现分化现象。
技术实现思路
本专利技术提供一种内皮祖细胞的制备方法,用于解决现有制备方法获得的内皮祖细胞纯度低、活力低、易出现分化的问题。本专利技术的技术方案如下:一种内皮祖细胞的制备方法,包括:a)将脐血进行分离,得到单个核细胞;b)将所述单个核细胞进行细胞培养,得到扩增细胞;c)将所述扩增细胞进行分选,得到内皮祖细胞,在培养体系中将所述内皮祖细胞进行扩增。优选的,步骤a)所述分离为Ficoll密度梯度离心法分离;所述Ficoll密度梯度离心法分离的离心力为200~500g;所述Ficoll密度梯度离心法分离的离心时间为15~30min。优选的,步骤a)所述脐血的离体时间为5~7h。优选的,步骤c)所述分选为磁珠分选;所述磁珠分选中,磁珠与所述扩增细胞的比例为每107~8个细胞加入20~50μL磁珠。优选的,所述磁珠分选具体为磁珠分选CD34+CD133+细胞。优选的,步骤b)所述单个核细胞的细胞密度为3~6×106cells/mL。进一步的,步骤b)将所述单个核细胞进行细胞培养之后,得到扩增细胞之前,还包括:筛选贴壁细胞。进一步的,步骤c)之后还包括:进行流式检测。优选的,步骤c)所述培养体系包括:无血清培养基、无血清替代物、5~20ng/mLSDF-1、10ng/mLEGF和5~20ng/mLIGF。本专利技术还提供上述技术方案所述培养体系在制备内皮祖细胞中的应用。综上所述,本专利技术提供了一种内皮祖细胞的制备方法,包括:a)将脐血进行分离,得到单个核细胞;b)将所述单个核细胞进行细胞培养,得到扩增细胞;c)将所述扩增细胞进行分选,得到内皮祖细胞,在培养体系中将所述内皮祖细胞进行扩增。实验结果表明,本专利技术制备方法能够在短时间内获得数量充足的内皮祖细胞,获得的内皮祖细胞纯度高、活力好、不容易出现分化。具体实施方式本专利技术提供了一种内皮祖细胞的制备方法,用于解决现有制备方法获得的内皮祖细胞纯度低、活力低、易出现分化的问题。下面将对本专利技术中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本专利技术保护的范围。一种内皮祖细胞的制备方法,包括:a)将脐血进行分离,得到单个核细胞;b)将单个核细胞进行细胞培养,得到扩增细胞;c)将扩增细胞进行分选,得到内皮祖细胞,在培养体系中将内皮祖细胞进行扩增。现有技术体外培养内皮祖细胞,内皮祖细胞容易出现分化,不利于回输后血管的形成。本专利技术制备方法获得的内皮祖细胞不容易出现分化,并且本专利技术制备方法能够在短时间内获得数量充足的内皮祖细胞,获得的内皮祖细胞纯度高、活力好。本专利技术中,步骤a)分离为Ficoll密度梯度离心法分离;所述Ficoll密度梯度离心法分离的离心力为200~500g;所述Ficoll密度梯度离心法分离的离心时间为15~30min。本专利技术中,步骤a)脐血的离体时间为5~7h。脐血离体时间的长短和数量直接影响内皮祖细胞的获取率,步骤a)脐血的离体时间为5~7h。本专利技术中,步骤c)分选为磁珠分选;所述磁珠分选中,磁珠与所述扩增细胞的比例为每107~8个细胞加入20~50μL磁珠。本专利技术中,磁珠分选具体为磁珠分选CD34+CD133+细胞。本专利技术制备方法增加了磁珠分选再进行内皮祖细胞的扩增,能够获得纯度一致的细胞群。本专利技术中,步骤b)单个核细胞的细胞密度为3~6×106cells/mL。进一步的,步骤b)将单个核细胞进行细胞培养之后,得到扩增细胞之前,还包括:筛选贴壁细胞。进一步的,步骤c)之后还包括:进行流式检测。培养条件是获得内皮祖细胞至关重要的因素。现有技术中,通过酶解脐静脉内皮细胞,获得的细胞活率受酶解液影响,往往活率较低,而且细胞种类较多。本专利技术采用Ficoll密度梯度离心法对脐血进行单个核细胞的分离,然后进行细胞培养,得到扩增细胞,再将扩增细胞进行磁珠分选,获得目标细胞后,进行内皮祖细胞大规模扩增。本专利技术所获得的细胞污染率极低,操作简单,能够显著提高分离效率,优化了提取条件分离的条件,获得数量大、纯度一致的内皮祖细胞。与现有技术相比,本专利技术采用了先扩增后筛选的实验步骤,该方法操作步骤简单,目标细胞获取率高,细胞起始数量足够、有利于后期细胞大规模扩增。此外,本专利技术优化了培养体系,大大缩短了培养周期。本专利技术脐血离体后采用低温保存,离体时间为3h,保证提取出活性高的细胞。本专利技术先进行单个核细胞的贴壁细胞和悬浮细胞的分离,对贴壁细胞进行扩增培养,提高目标细胞的含量,使得分选后,目标细胞数量增多,极大的利于扩增培养。本专利技术实验操作时间短,细胞获取量大。本专利技术中,步骤c)培养体系包括:无血清培养基、无血清替代物、5~20ng/mLSDF-1、10ng/mLEGF和5~20ng/mLIGF。现有培养体系为DMEM高糖基础培养基和10%FBS及适量的抗生素,但使用现有培养体系培养内皮祖细胞,内皮祖细胞容易出现分化不增殖。本专利技术培养体系能够避免内皮祖细胞分化并使内皮祖细胞增殖速度加快。本专利技术还提供上述技术方案培养体系在制备内皮祖细胞中的应用。实施例1在医院内获取50~70mL人脐血,在3h内使用Ficoll梯度离心法对脐血进行分离,得到单个核细胞。Ficoll梯度离心法分离的离心力为300g;Ficoll密度梯度离心法分离的离心时间为20min。使用DMEM高糖培养基+10%FBS重悬单个核细胞,调整细胞密度为3×106cells/mL,接种于10cm平皿,细胞悬液10mL/皿。于48h后,去掉上清,筛选得到贴壁细胞。用PBS清洗贴壁细胞1~2遍后,加入DMEM高糖培养基+10%FBS,继续培养已贴壁的细胞,得到扩增细胞。待扩增细胞融合率达70%左右,加入0.25%胰酶-0.02%EDTA消化细胞,制备形成细胞悬液。通过磁珠筛选出CD34+CD133+的细胞,每107个细胞加入25μL磁珠,筛选得到内皮祖细胞。实施例2将实施例1分选后的内皮祖细胞在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种内皮祖细胞的制备方法,其特征在于,包括:a)将脐血进行分离,得到单个核细胞;b)将所述单个核细胞进行细胞培养,得到扩增细胞;c)将所述扩增细胞进行分选,得到内皮祖细胞,在培养体系中将所述内皮祖细胞进行扩增。

【技术特征摘要】
2018.01.23 CN 20181006412631.一种内皮祖细胞的制备方法,其特征在于,包括:a)将脐血进行分离,得到单个核细胞;b)将所述单个核细胞进行细胞培养,得到扩增细胞;c)将所述扩增细胞进行分选,得到内皮祖细胞,在培养体系中将所述内皮祖细胞进行扩增。2.根据权利要求1所述的内皮祖细胞的制备方法,其特征在于,步骤a)所述分离为Ficoll密度梯度离心法分离;所述Ficoll密度梯度离心法分离的离心力为200~500g;所述Ficoll密度梯度离心法分离的离心时间为15~30min。3.根据权利要求1所述的内皮祖细胞的制备方法,其特征在于,步骤a)所述脐血的离体时间为5~7h。4.根据权利要求1所述的内皮祖细胞的制备方法,其特征在于,步骤c)所述分选为磁珠分选;所述磁珠分选中,磁珠与所述扩增细...

【专利技术属性】
技术研发人员:马颖郑皓钧
申请(专利权)人:广东颜值科技有限公司
类型:发明
国别省市:广东,44

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