本发明专利技术公开了重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产N‑乙酰神经氨酸的方法，属于遗传工程领域。本发明专利技术是以枯草芽孢杆菌作为表达宿主，通过游离质粒pP43NMK过量来源于念珠藻(Anabaena sp.CH1)的N‑乙酰氨基葡萄糖异构酶(AGE)和来源于大肠杆菌(Escherichia coli K12)的N‑乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA)，得到了积累N‑乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌基因工程菌，以N‑乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸钠为底物进行全细胞转化，N‑乙酰神经氨酸产量达到21.89g/L，为实现利用食品安全级的枯草芽孢杆菌生产N‑乙酰神经氨酸工业化奠定了基础。
Whole cell transformation of Bacillus subtilis to produce N- acetylneuraminic acid
The invention discloses a method for the production of N acetyl neuraminic acid by recombinant Bacillus subtilis whole cell transformation, belonging to the field of genetic engineering. The present invention is with Bacillus subtilis as the host, the N acetylglucosamine isomerase (AGE) of Anabaena sp.CH1 and N acetyl neuraminidase (NanA) derived from the Escherichia coli (Escherichia coli K12) from the free plasmid pP43NMK, and the weight of the accumulation of N acetyl neuraminidase (NanA). The gene engineering bacteria of Bacillus subtilis were transformed with N acetyl glucosamine and pyruvate as substrates, and the yield of N acetyl neuraminic acid reached 21.89g/L, which laid the foundation for the industrialization of Bacillus subtilis to produce N acetyl neuraminic acid by food safety grade Bacillus subtilis.
【技术实现步骤摘要】
重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产N-乙酰神经氨酸的方法
本专利技术涉及重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产N-乙酰神经氨酸的方法，属于遗传工程领域。
技术介绍
N-乙酰神经氨酸是一种含9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，是最常见、分布最广的一种唾液酸，作为唾液酸家族其他成员生物合成的前体。N-乙酰神经氨酸是一种广泛存在于细胞表面的信号分子,在糖蛋白末端存在着唾液酸残基，一定程度上决定了特定糖蛋白的大分子结构，参与细胞识别、信号转导等多个生理过程。N-乙酰神经氨酸能调节IgG的抗炎活性，增强婴儿免疫力，影响神经细胞的完整性、渗透性及活性，促进婴儿大脑的发育，此外作为药物在癌症、炎症及流感等治疗有重大的应用。目前N-乙酰神经氨酸主要是从牛初乳、卵黄、酪蛋白、燕窝等含量相对丰富的天然材料中提取和通过一系列反应化学法合成，成本高、工艺复杂分离困难，对环境污染严重，不适合工业化生产。现有生产方法产量低、成本高，难以满足市场需求，因而如何建立经济高效的生产方法生产更加安全可靠的N-乙酰神经氨酸成为一个值得深入探讨的问题。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generallyregardedassafe”(GRAS)安全级别。而且枯草芽孢杆菌无N-乙酰神经氨酸分解代谢途径。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌和全细胞转化法结合是生产食品安全级N-乙酰神经氨酸的有效途径。全细胞催化反应条件温和、可以实现连续多步催化反应、省去繁琐的酶纯化过程、专一性好、产品纯度高。全细胞催化法作为对环境友好，是低投资的前瞻性工艺路线。与化学合成法相比，全细胞催化法应用专一性的酶对前体物质进行专一性地酶促反应，副产物少，且反应条件温和、污染低；与微生物发酵法相比，全细胞催化法生产周期更短，操作条件更容易控制，细胞或酶易再生、可循环使用，更适合大规模生产；与酶法合成相比，全细胞催化法在细胞内进行催化合成，能够通过胞内产生的ATP激活N-乙酰氨基葡萄糖异构酶，还可省去繁琐耗时的酶纯化过程，并且生产过程中的反应是通过生命体自动调节方式进行，可充分利用微生物代谢产生的ATP，避免了添加昂贵的ATP，从而使反应过程更高效率、低成本、绿色环保。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是构建一种在重组枯草芽孢杆菌中利用全细胞转化法生产N-乙酰神经氨酸的方法。为解决上述技术问题，本专利技术的第一个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，共表达N-乙酰氨基葡萄糖异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶来源于念珠藻(Anabaenasp.)CH1。在本专利技术的一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)K12。在本专利技术的一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以pP43NMK为载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌B6CG(Bacillussubtilis168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔptaΔptsG::lox72Δctc::gna1)为宿主(该菌株于公开号为CN106929461A的专利申请文件中公开)。本专利技术的第二个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，是将来源于念珠藻(Anabaenasp.CH1)的N-乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因以及来源于大肠杆菌(EscherichiacoliK12)的N-乙酰神经氨酸醛缩酶编码基因构建到质粒pP43NMK中，再转化到枯草芽孢杆菌B6CG中。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体pP43NMK的构建方法参见ZhangXZ,CuiZL,HongQ,LiSP.High-levelexpressionandsecretionofmethylparathionhydrolaseinBacillussubtilisWB800.Appliedandenvironmentalmicrobiology.2005；71(7):4101-3。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：1)构建重组质粒；克隆念珠藻(Anabaenasp.CH1)的N-乙酰氨基葡萄糖异构酶，以及来源于大肠杆菌(EscherichiacoliK12)的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，连接到重组表达质粒pP43NMK上；2)构建产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌：将上述重组表达载体转化枯草芽孢杆菌，得到产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillussubtilis168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔptaΔptsG::lox72Δctc::gna1；所述重组表达载体为pP43NMK。本专利技术的第三个目的是提供一种应用所述重组枯草芽孢杆菌生产N-乙酰神经氨酸的方法，所述方法是以重组枯草芽孢杆菌作为生物催化剂进行全细胞转化。在本专利技术的一种实施方式中，所述全细胞转化是将重组枯草芽孢杆菌的菌体按照15～20OD/mol底物的添加量加入至转化体系中。在本专利技术的一种实施方式中，所述全细胞转化是以丙酮酸钠和N-乙酰氨基葡萄糖为底物进行转化。在本专利技术的一种实施方式中，所述全细胞转化是将重组枯草芽孢杆菌的菌体按照15～20OD/mol丙酮酸钠，30～40OD/molN-乙酰氨基葡萄糖的菌体添加量加入至转化体系中。在本专利技术的一种实施方式中，所述转化体系含有(按g/L计)：0.01MPBS:NaCl8，KCl0.2，Na2HPO41.44，KH2PO40.24，1.6M丙酮酸钠，0.6MN-乙酰氨基葡萄糖，0.01MMgCl2，0.4％TritonX-100，pH7.2～7.4。在本专利技术的一种实施方式中，所述转化是在28～30℃下反应0～60h。在本专利技术的一种实施方式中，所述转化是将所述重组枯草芽孢杆菌在35～37℃，200～220rpm条件下培养20～22h处于对数后期的细胞，按照OD600为30加入转化体系中，于为30℃，220rpm条件下生产N-乙酰神经氨酸。在本专利技术的一种实施方式中，在相同的转化条件下，处于对数后期20～22h的菌体所达到的转化效果优于对数中期和稳定期的菌体。本专利技术还提供所述方法在制备食品、药品或保健品方面的应用。本专利技术还提供所述重组枯草芽孢杆菌在制备含N-乙酰神经氨酸的产品中的应用。有益效果：本专利技术提供的重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产N-乙酰神经氨酸的方法，其产量可达到24.94g/L，该方法简单，便于使用，能够用于食品领域产品的生产，具有很好地应用前景，为实现利用食品安全级的枯草芽孢杆菌生N-乙酰神经氨酸工业化奠定了基础。附图说明图1为单细胞全细胞转化底物和产物的浓度关系。具体实施方式N-乙酰神经氨酸的测定方法：高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent1200，UV检测器，HPX-87H柱(300×7.8mm，5μm)，流动相：5mM稀硫酸，流速0.50mL/min，柱本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，共表达N‑乙酰氨基葡萄糖异构酶和N‑乙酰神经氨酸醛缩酶。
【技术特征摘要】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，共表达N-乙酰氨基葡萄糖异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶。2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶来源于念珠藻(Anabaenasp.)；所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)。3.根据权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以pP43NMK为载体。4.一种构建权利要求1～3任一所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，将编码N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的基因以及编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶的基因构建到质粒pP43NMK中，再转化到枯草芽孢杆菌中。5.权利要求1～3任一所述重组枯草芽孢杆...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，堵国成，刘延峰，李江华，赵林，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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