一种甲烷单细胞蛋白的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种利用甲烷生产单细胞蛋白的工业化生产方法，为有效解决我国畜禽、水产动物饲料蛋白短缺，解决养殖业生产成本上涨等问题提供一条新方法。本发明专利技术利用荚膜甲基球菌Methylococcus capsulatus ATCC33009、土壤短芽孢杆菌Brevibacillus agri ACCC10247以及嗜热嗜气硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus thermoaerophilus ACCC10261中的一种或者多种菌株利用甲烷生产单细胞蛋白，所生产单细胞蛋白粗蛋白含量达70%以上，发酵用菌种对发酵条件适应性强，生产的饲料安全无毒。

Production method of a single cell protein of methane

This invention relates to an industrialized production method using methane to produce single cell protein. It provides a new method to solve the shortage of animal and aquatic animal feed protein and to solve the rising production cost of livestock breeding industry in China. The present invention makes use of one or more strains of methococcus Methylococcus capsulatus ATCC33009, Bacillus subtilis Brevibacillus agri ACCC10247, and thermophilic thiamine Bacillus Aneurinibacillus thermoaerophilus ACCC10261 to produce single cell protein by methane production. The crude protein content is over 70%, and the fermented strain is highly adaptable to fermentation conditions, and the feed produced is safe and non-toxic.

【技术实现步骤摘要】
一种甲烷单细胞蛋白的生产方法
本专利技术属于生物
，涉及一种转化甲烷生产单细胞蛋白的菌株及其在单细胞蛋白生产方法。具体指在利用甲烷资源，形成新的甲烷下游产品生产链，将甲烷转化生成单细胞蛋白产品，解决近年来动物性蛋白饲料价格上涨，养殖行业成本增加、传统单细胞蛋白生产受原料来源限制，不能大规模生产等问题，有绿色环保、生产能耗低、不受环境和气候影响、可连续生产、易于控制等优点，是传统蛋白饲料新的替代源。
技术介绍
随着畜牧业的快速发展，动物饲料资源短缺问题越来越受到人们的关注，尤其是动物蛋白质饲料缺乏，严重影响到畜牧业的发展。动物饲料占据整个养殖期间养殖生产成本的大部分资金，然而在所有的动物饲料中，尤其是动物蛋白质饲料缺乏严重。但是，全球性的粮食危机已开始显现，全球粮食储备水平不足年消费量的15%，以大豆与玉米为主要原料的饲料行业受到严重冲击。近年来，动物饲料蛋白的价格逐年上涨，养殖成本不断上升。以动物蛋白饲料鱼粉为例，我国的鱼粉需求量非常大，但我国渔业资源匮乏，鱼粉产量低，工业化水平低，根据世界粮农组织（2013年）统计称，我国鱼粉年产量约120万吨，仅占国内鱼粉消费总量的一半，并且国产鱼粉的粗蛋白质含量低，脂肪含量相对较高，所含氨基酸比例不平衡等不足，远不能满足国内动物蛋白饲料需求。我国每年都需要从秘鲁（约80％）、智利等国进口大量的鱼粉来弥补国产鱼粉产量的不足。但是，近年来由于鱼粉的主要出口国不断缩减捕鱼配额以及气候变化与环境恶化等原因造成的渔业资源的衰退，秘鲁等国禁捕令的实施，鱼粉价格也持续走高。进口鱼粉的价格比较高昂，并且进口量受到国外的限制，因此开发新型廉价的蛋白源，降低养殖行业的生产成本势在必行。单细胞蛋白（Singlecellprotein，SCP）又称微生物蛋白，指的是从纯培养的微生物细胞中提取得到的总蛋白，可作为人及动物蛋白的补充。研究已经表明，使用微生物产生的单细胞蛋白安全无毒，含有丰富的蛋白质、氨基酸和多种维生素，可以用作饲料促进畜禽生产，提高饲料利用率，代替鱼粉、大豆、骨粉、肉类和脱脂奶粉等蛋白补充饲料，具有较高的附加值。在日粮中添加单细胞蛋白质饲料，能提高饲料利用率，增强机体免疫力，生猪瘦肉率、蛋鸡产蛋量和奶牛产奶量也会得以提高。由细菌以甲烷为原料生产的新型单细胞蛋白的蛋白含量69%-80%，远远高于工业生产饲料15%-20%的蛋白含量，具有较高的经济效益和广阔的市场空间。单细胞蛋白作为动物的蛋白质饲料，不但可以在一定程度上缓解我国蛋白质资源的短缺危机，满足动物的生长和生产，更有利于降低养殖行业的生产成本，促进整个畜牧业的可持续健康发展。
技术实现思路
针对上述情况，本专利技术之目的就是提供一种甲烷单细胞蛋白的工业化生产方法，可有效解决动物饲料蛋白紧缺，降低养殖业成本。本专利技术解决的技术方案是，包括如下步骤：1）、使用的菌株为荚膜甲基球菌MethylococcuscapsulatusATCC33009、土壤短芽孢杆菌BrevibacillusagriACCC10247以及嗜热嗜气硫胺素芽孢杆菌AneurinibacillusthermoaerophilusACCC10261中的一种或几种：将甘油管保藏的菌种0.5mL接种至无机盐试管斜面培养基（试管规格180mm×20mm）上，通入经过0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，30℃培养4d，即得斜面种子，所述的无机盐试管斜面培养基为在1L水中加入1.5gK2HPO4、0.5gKH2PO4、0.2gMgSO4•7H2O、1.0gNaCl、1.0g（NH4）2SO4和2.0g琼脂，pH自然。用无菌水将斜面种子全部冲洗下来，以无机盐液体培养基体积1%-5%的接种量接入到含有石蜡油的无机盐液体培养基中，通入经过0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养4-6d，菌体OD600达到9-10，获得摇瓶种子，所述的无机盐液体培养基为在1L水中加入1.5gK2HPO4、0.5gKH2PO4、0.2gMgSO4•7H2O、1.0gNaCl和1.0g（NH4）2SO4，pH自然。所述含甲烷的体系中石蜡油添加量为2.0%-3.0%(v/v)。所述含甲烷的体系中甲烷和空气体积比为1:1-1:5，每24h-48h换气一次；2）、一级种子培养：A、一级种子培养在50L的发酵罐中进行，步骤如下：按步骤1）所述方法在50L罐中配制30L的无机盐液体培养基，加入2.5％（v/v）的石蜡油，打开蒸汽阀，使蒸汽进发酵罐夹套层，对培养基进行灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min，对液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样口进行灭菌，灭菌10min即可，灭菌结束后，打开进气阀，向发酵罐中通入无菌空气，使罐体内空气压力一直要高于罐体外大气压，打开冷却水阀门，使冷却水进发酵罐夹套层，对无机盐液体培养基进行降温，当无机盐液体培养基温度降至25-35℃时，开始接种；B、摇瓶种子1000mL从50L发酵罐接种口倒入，随后控制发酵温度在20-30℃，转速150rpm，通入经过0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，培养5-7d后，得一级种子；3）、二级种子培养：二级种子培养在5m3发酵罐中进行，二级种子培养基采用无机盐液体培养基，步骤如下：5m3发酵罐中装含2.5％（v/v）石蜡油的无机盐液体培养基体积为3m3；所述的无机盐液体培养基为：1L水中加入1.5gK2HPO4、0.5gKH2PO4、0.2gMgSO4•7H2O、1.0gNaCl和1.0g（NH4）2SO4，pH自然；用2）A步骤中的灭菌方法对含2.5％（v/v）石蜡油的无机盐液体培养基进行灭菌，灭菌完成后，将培养好的一级种子30L接种到3m3的无机盐液体培养基中，接种量为1%，接种前应检查一级种子质量，镜检种子菌体健壮、形态一致、均匀整齐，无杂菌污染，接种时二级种子罐（二级种子罐即5m3发酵罐）罐压在0.01-0.03MPa，一级种子罐罐压在0.05-0.1MPa，通过气压将一级种子从一级种子罐压到二级种子罐中，接种完成后，保持二级种子罐温度20-30℃，1：1-1.5vvm（vvm表示通风量为发酵液体积的1-1.5倍/分钟）通入经过0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，罐压0.05MPa，pH自然，培养6-8d，得二级种子；4）、发酵罐甲醇蛋白生产发酵培养基为与3）步骤中的二级种子培养基相同，开启进料泵，调节进料阀门大小，以控制发酵培养基的进料速度为3-4m3/h，同时打开蒸汽阀门，将蒸汽与发酵培养基混合，使发酵培养基温度达到121-125℃，进入在层流罐中维持20min后，进入50m3发酵罐中，进料完毕后，关闭进料阀，并将50m3发酵罐温度维持在121℃30min，此时，用蒸汽对与50m3发酵罐相连的空气过滤器、发酵罐取样口、出料口、排气口管道进行灭菌，保证50m3发酵罐及与之相连管道呈无菌状态，灭菌结束后，对50m3发酵罐内的发酵培养基降温到30℃-35℃；然后将二级种子以发酵培养基体积10%的接种量接种到50m3发酵罐内开始发酵，发酵温度20-30℃，1：1.5-2vvm通入经过0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷，罐压0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甲烷单细胞蛋白的工业化生产方法，其特征在于，包括如下步骤：1）、使用荚膜甲基球菌Methylococcus capsulatus ATCC33009、土壤短芽孢杆菌Brevibacillus agri ACCC10247以及嗜热嗜气硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus thermoaerophilus ACCC10261中任意一种或任意两种以上混合物；将甘油管保藏的菌种0.5mL 接种至无机盐试管斜面培养基上，通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，30℃培养4 d，即得斜面种子，所述的无机盐试管斜面培养基为在1L 水中加入1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4 •7H2O、1.0g NaCl、1.0g（NH4）2SO4和20g 琼脂，pH 自然；用无菌水将斜面种子全部冲洗下来，以无机盐液体培养基体积1%‑5% 的接种量接入到含有石蜡油的无机盐液体培养基中，通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养4‑6 d，菌体OD600 达到9 ～10，获得摇瓶种子，所述的无机盐液体培养基为在1L 水中加入1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4 •7H2O、1.0g NaCl和1.0g（NH4）2SO4，pH 自然；所述含甲烷的体系中石蜡油添加量为2.0%‑3.0% v/v；所述含甲烷的体系中甲烷和空气体积比为1:1‑1:5，每24h‑48h 换气一次；2）、一级种子培养：A、一级种子培养在50L的发酵罐中进行，步骤如下：按步骤1）所述方法在50L 罐中配制30L 的无机盐液体培养基，加入2.5％v/v的石蜡油，打开蒸汽阀，使蒸汽进发酵罐夹套层，对培养基进行灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min，对液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样口进行灭菌，灭菌10min 即可，灭菌结束后，打开进气阀，向发酵罐中通入无菌空气，使罐体内空气压力一直要高于罐体外大气压，打开冷却水阀门，使冷却水进发酵罐夹套层，对无机盐液体培养基进行降温，当无机盐液体培养基温度降至25‑35℃时，开始接种；B、摇瓶种子1000mL 从50L 发酵罐接种口倒入，随后控制发酵温度在20‑30℃，转速150rpm，通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，培养5‑7d 后，得一级种子；3）、二级种子培养：二级种子培养在5m3 发酵罐中进行，二级种子培养基采用无机盐液体培养基，步骤如下：5m3 发酵罐中装含2.5％v/v石蜡油的无机盐液体培养基体积为3m3 ；所述的无机盐液体培养基为：1L 水中加入1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4 •7H2O、1.0g NaCl和1.0g（NH4）2SO4，pH 自然；用2）A 步骤中的灭菌方法对含2.5％v/v石蜡油的无机盐液体培养基进行灭菌，灭菌完成后，将培养好的一级种子30L 接种到3m3的无机盐液体培养基中，接种量为1%，接种时二级种子罐罐压在0.01‑0.03MPa，一级种子罐罐压在0.05‑0.1MPa，通过气压将一级种子从一级种子罐压到二级种子罐中，接种完成后，保持二级种子罐温度20‑30℃，1 ：1‑1.5vvm通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，罐压0.05MPa，pH自然，培养6‑8d，得二级种子；4）、发酵罐甲醇蛋白生产发酵培养基为与3）步骤中的二级种子培养基相同，开启进料泵，调节进料阀门大小，以控制发酵培养基的进料速度为3‑4m3/h，同时打开蒸汽阀门，将蒸汽与发酵培养基混合，使发酵培养基温度达到121‑125℃，进入在层流罐中维持20min 后，进入50m3 发酵罐中，进料完毕后，关闭进料阀，并将50m3 发酵罐温度维持在121℃ 30min，此时，用蒸汽对与50m3 发酵罐相连的空气过滤器、发酵罐取样口、出料口、排气口管道进行灭菌，保证50m3 发酵罐及与之相连管道呈无菌状态，灭菌结束后，对50m3 发酵罐内的发酵培养基降温到30℃‑35℃ ；然后将二级种子以发酵培养基体积10% 的接种量接种到50m3 发酵罐内开始发酵，发酵温度20‑30℃，1 ：1.5‑2 vvm通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷，罐压0.04MPa，pH自然，培养7‑9d得发酵液；5）、出料发酵结束后，利用罐压将发酵液从出料管道导入到发酵液储罐中，静置，沉降4‑8 小时，沉降液经卧螺离心机离心，得菌泥，收集到储存罐中，加入菌泥体积1/5 的清水，搅拌均匀，进入喷雾干燥机，喷雾干燥，收集蛋白干粉，包装。...

【技术特征摘要】
1.一种甲烷单细胞蛋白的工业化生产方法，其特征在于，包括如下步骤：1）、使用荚膜甲基球菌MethylococcuscapsulatusATCC33009、土壤短芽孢杆菌BrevibacillusagriACCC10247以及嗜热嗜气硫胺素芽孢杆菌AneurinibacillusthermoaerophilusACCC10261中任意一种或任意两种以上混合物；将甘油管保藏的菌种0.5mL接种至无机盐试管斜面培养基上，通入经过0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，30℃培养4d，即得斜面种子，所述的无机盐试管斜面培养基为在1L水中加入1.5gK2HPO4、0.5gKH2PO4、0.2gMgSO4•7H2O、1.0gNaCl、1.0g（NH4）2SO4和20g琼脂，pH自然；用无菌水将斜面种子全部冲洗下来，以无机盐液体培养基体积1%-5%的接种量接入到含有石蜡油的无机盐液体培养基中，通入经过0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养4-6d，菌体OD600达到9～10，获得摇瓶种子，所述的无机盐液体培养基为在1L水中加入1.5gK2HPO4、0.5gKH2PO4、0.2gMgSO4•7H2O、1.0gNaCl和1.0g（NH4）2SO4，pH自然；所述含甲烷的体系中石蜡油添加量为2.0%-3.0%v/v；所述含甲烷的体系中甲烷和空气体积比为1:1-1:5，每24h-48h换气一次；2）、一级种子培养：A、一级种子培养在50L的发酵罐中进行，步骤如下：按步骤1）所述方法在50L罐中配制30L的无机盐液体培养基，加入2.5％v/v的石蜡油，打开蒸汽阀，使蒸汽进发酵罐夹套层，对培养基进行灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min，对液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样口进行灭菌，灭菌10min即可，灭菌结束后，打开进气阀，向发酵罐中通入无菌空气，使罐体内空气压力一直要高于罐体外大气压，打开冷却水阀门，使冷却水进发酵罐夹套层，对无机盐液体培养基进行降温，当无机盐液体培养基温度降至25-35℃时，开始接种；B、摇瓶种子1000mL从50L发酵罐接种口倒入，随后控制发酵温度在20-30℃，转速150rpm，通入经过0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，培养5-7d后，得一级种子；3）、二级种子培养：二级种子培养在5m3发酵罐中进行，二级种子培养基采用无机盐液体培养基，步骤如下：5m3发酵罐中装含2.5％v/v石蜡油的无机盐液体培养基体积为3m3；所述的无机盐液体培养基为：1L水中加入1.5gK2HPO4、0.5gKH2PO4、0.2gMgSO4•7H2O、1.0gNaCl和1.0g（NH4）2SO4，pH自然；用2）A步骤中的灭菌方法对含2.5％v/v石蜡油的无机盐液体培养基进行灭菌，灭菌完成后，将培养好的一级种子30L接种到3m3的无机盐液体培养基中，接种量为1%，接种时二级种子罐罐压在0.01-0.03MPa，一级种子罐罐压在0.05-0.1MPa，通过气压将一级种子从一级种子罐压到二级种子罐中，接种完成后，保持二级种子罐温度20-30℃，1：1-1.5vvm通入经过0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，罐压0.05MPa，pH自然，培养6-8d，得二级种子；4）、发酵罐甲醇蛋白生产发酵培养基为与3）步骤中的二级种子培养基相同，开启进料泵，调节进料阀门大小，以控制发酵培养基的进料速度为3-4m3/h，同时打开蒸汽阀门，将蒸汽与发酵培养基混合，使发酵培养基温度达到121-125℃，进入在层流罐中维持20min后，进入50m3发酵罐中，进料完毕后，关闭进料阀，并将50m3发酵罐温度维持在121℃30min，此时，用蒸汽对与50m3发酵罐相连的空气过滤器、发酵罐取样口、出料口、排气口管道进行灭菌，保证50m3发酵罐及与之相连管道呈无菌状态，灭菌结束后，对50m3发酵罐内的发酵培养基降温到30℃-35℃；然后将二级种子以发酵培养基体积10%的接种量接种到50m3发酵罐内开始发酵，发酵温度20-30℃，1：1.5-2v...

【专利技术属性】
技术研发人员：储卫华，周淑鑫，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32