一种植乳物杆菌GBE48及其应用以及α-葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法技术

本发明专利技术提供了一种植物乳杆菌GBE48及其应用以及α‑葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法。本发明专利技术植物乳杆菌GBE48(CGMCCNo.15130)具有较强的耐受胃肠道逆环境能力，并对α‑葡萄糖苷酶活性抑制率较高，是一种防治糖尿病的最有潜力菌株。同时，本发明专利技术方法通过对于实验反应体系的建立和优化，能够实现对不同菌株的α‑葡萄糖苷酶活性抑制的测定，并实现对植物乳杆菌来源的α‑葡萄糖苷酶抑制剂的筛选，填补了相关研究领域的空白。

A Lactobacillus Lactobacillus GBE48 and its application and quantitative detection of alpha glucosidase activity inhibition

The invention provides a Lactobacillus plantarum GBE48 and its application as well as a quantitative detection method for alpha glucosidase activity inhibition. Lactobacillus plantarum GBE48 (CGMCCNo.15130) has a strong tolerance to the reverse of the gastrointestinal tract and has a high inhibitory rate on the activity of alpha glucosidase, which is the most potential strain for the prevention and treatment of diabetes. At the same time, through the establishment and optimization of the experimental reaction system, the method can be used to determine the inhibition of the activity of alpha glucosidase activity of different strains and the screening of alpha glucosidase inhibitors from Lactobacillus plantarum, which fills the gap in the related research fields.

【技术实现步骤摘要】
一种植乳物杆菌GBE48及其应用以及α-葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法
本专利技术涉及微生物领域，具体而言，涉及一种植物乳杆菌GBE48及其应用以及α-葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法。
技术介绍
糖尿病(DiabetesMellitus,DM)是由于机体胰岛素分泌不足、或分泌胰岛素功能受损所引起的持续高血糖的代谢紊乱疾病，已成为公认危害人体健康的疾病，三多一少是其典型特征。目前，预防和治疗糖尿病的药物仍以化学药剂为主，由于化学药剂副作用大，因而也使得对安全、天然药物的研究成为热点。微生物来源的酶抑制剂的筛选研究成为糖尿病防治领域新的研究热点，其中α-葡萄糖苷酶抑制剂已被第三次亚太地区糖尿病治疗药物指南推荐为降低餐后血糖的一线药物。酶抑制剂的筛选方法具有特异性强、筛选样品量大、简便、灵敏等优点，适用于各种益生乳酸菌发酵液的大量筛选与研究，可为糖尿病的防治提供有效方法。目前现有提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的专利方法，大多是直接以大麦、红茶、海洋褐藻、中药、甘草、荔枝、杨梅果肉、罗汉果、青稞麸皮、土大黄、猕猴桃根或田基黄、茶花粉、苍耳籽、松蒿、山萝花、冬凌草、矮生二裂叶委陵菜、大豆、辣椒叶、大叶补血草和夏枯草等植物为原料进行提取制备。微生物来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂也有一定研究，大多来源于链酶菌属、芽孢杆菌属、游牧放线菌属和真菌。例如，现有技术CN105385619A所公开的《淡紫灰链霉菌及其用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法与应用》；现有技术CN105176860A所公开的《一种蜡样芽孢杆菌及其利用蜡样芽孢杆菌制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法》；现有技术CN101371869A所公开的《一种来源于纳豆的α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法》等。然而，现有专利中，并没有对于产α-葡萄糖苷酶抑制剂菌株的筛选方法进行较为细致的研究。尽管国内有2篇相关的文献报道，例如吕嘉枥等人发表的《具有α-葡萄糖苷酶抑制性益生乳酸菌的筛选》和陈佩等人《1株具有潜在降糖作用的益生菌的筛选》，但是这两篇文章都是关于α-葡萄糖苷酶抑制性益生乳酸菌的筛选，而有关植物乳杆菌来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂的测定方法，尤其对α-葡萄糖苷酶活性抑制试验反应体系的优化，现有技术中却没有相关的研究和报道。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种植物乳杆菌，所述的植物乳杆菌具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。本专利技术的第二目的在于提供一种所述的植物乳杆菌的应用。本专利技术的第三目的在于提供一种α-葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，命名为GBE48，微生物保藏号为：CGMCCNo.15130。同时，本专利技术还提供了所述的植物乳杆菌在α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用；和/或，所述的植物乳杆菌在制备糖尿病防治药物中的应用。进一步的，本专利技术还提供了一种α-葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法，所述方法包括如下步骤：将待检测菌株活化后，制备待测菌株上清液；在孔板中加入PNPG底物溶液和PBS缓冲液以及待测菌株上清液，混合反应后，加入α-葡萄糖苷酶溶液，继续反应，然后加入Na2CO3溶液终止反应，将反应液在波长405nm处测定吸光值，记为ODA；同时，分别以：不含有α-葡萄糖苷酶但含有待测菌株上清液的体系B，含有α-葡萄糖苷酶但不含有待测菌株上清液的体系C，以及不含有α-葡萄糖苷酶但含有待测菌株上清液的体系D为对照组，分别测定各组反应液在波长405nm处测定吸光值，分别记为ODB、ODC，以及ODD；然后，按照如下公式计算α-葡萄糖苷酶活性抑制率：α-葡萄糖苷酶活性抑制率＝[1-(ODA-ODB)/(ODC-ODD)]×100％；其中，所述待测菌株包括本专利技术所述的植物乳杆菌。优选的，本专利技术所述方法中，所述菌株活化包括如下步骤：将冷藏保存的菌株接入培养基中，然后在37℃下培养，活化三代后制备菌株上清液；和/或，所述菌株上清液的制备包括如下步骤：将活化后的菌株接入培养基中培养，得到活菌数量大于1×109的发酵液，然后离心收集上清液，无菌过滤后得到菌株上清液。优选的，本专利技术所述方法中，所述PNPG底物溶液的浓度为1.5mmol/L，用量为50μL。优选的，本专利技术所述方法中，PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为6.8，用量为15μL。优选的，本专利技术所述方法中，所述待测菌株上清液的用量为15μL。优选的，本专利技术所述方法中，所述α-葡萄糖苷酶溶液的酶活力为20U/mL，用量为70μL。优选的，本专利技术所述方法中，所述混合反应的温度为37℃，时间为10min；和/或，所述继续反应的温度为37℃，时间为50min。优选的，本专利技术所述方法中，所述Na2CO3溶液的浓度为0.1mol/L，用量为70μL。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术植物乳杆菌GBE48具有较强的耐受胃肠道逆环境能力，并对α-葡萄糖苷酶活性抑制率较高，可以成为防治糖尿病的最有潜力菌株；(2)本专利技术检测方法能够高效、准确的实现不同菌株对于α-葡萄糖苷酶抑制活性的测试，从而能够有效的筛选出对于α-葡萄糖苷酶活性抑制率较高的菌株，填补了相关领域的空白。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为底物浓度对OD值影响实验结果图；图2为α-葡萄糖苷酶对OD值影响实验结果图；图3为反应时间对OD值影响实验结果图；图4为终止液用量对OD值影响实验结果图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。有鉴于α-葡萄糖苷酶抑制剂对于糖尿病防治具有良好的效果作用，而目前并没有对微生物来源的对于α-葡萄糖苷酶活性抑制试验反应体系的深入研究，本专利技术特提供了一种α-葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法。具体的，本专利技术所述α-葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法包括如下步骤：(a)将待检测菌株活化：优选的，此步骤中，待测菌株包括本专利技术所提供的植物乳杆菌GBE48，生物保藏号为CGMCCNo.15130。同时，为了进一步对其α-葡萄糖苷酶活性进行参考和比较，此步骤中还以商业菌鼠李糖乳杆菌LGG(LactobacillusrhamnosusGG,ATCC53103，购自于美国菌种保藏中心，又称美国模式菌种收集中心)作为阳性参照物；将冷藏保存的菌株优选的按照3％的接入量，接入到5mL液体MRS培养基中，然后在37℃下培养，培养的时间优选的为18h，活化三代后用于制备菌株上清液。(b)菌株上清液制备：将活化后的菌株优选的按照3％的接入量，接入到10mL液体MRS培养基中，然后优选的在37℃下培养18h，得到活菌数量大于1×109的发酵液，然后离心收集上清液，优选的以滤膜过滤，得到菌株上清液。(c)反应体系实验测试的反应体系优选的在CS016-0096孔板(每孔350μL)中进行，经过筛选和测试，反应体系的体积优选的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，命名为GBE48，微生物保藏号为：CGMCC No.15130。

【技术特征摘要】
1.一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，命名为GBE48，微生物保藏号为：CGMCCNo.15130。2.权利要求1所述的植物乳杆菌在α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用；和/或，权利要求1所述的植物乳杆菌在制备糖尿病防治药物中的应用。3.一种α-葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将待检测菌株活化后，制备待测菌株上清液；在孔板中加入PNPG底物溶液和PBS缓冲液以及待测菌株上清液，混合反应后，加入α-葡萄糖苷酶溶液，继续反应，然后加入Na2CO3溶液终止反应，将反应液在波长405nm处测定吸光值，记为ODA；同时，分别以：不含有α-葡萄糖苷酶但含有待测菌株上清液的体系B，含有α-葡萄糖苷酶但不含有待测菌株上清液的体系C，以及不含有α-葡萄糖苷酶但含有待测菌株上清液的体系D为对照组，分别测定各组反应液在波长405nm处测定吸光值，分别记为ODB、ODC，以及ODD；然后，按照如下公式计算α-葡萄糖苷酶活性抑制率：α-葡萄糖苷酶活性抑制率＝[1-(ODA-ODB)/(ODC-ODD)]×100％；其中，所述待测菌株包...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢远红，刘慧，张红星，高秀芝，熊利霞，金君华，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京,11