一种融合蛋白、试剂盒以及CHIP-seq检测方法技术

本发明专利技术涉及一种融合蛋白、试剂盒以及CHIP‑seq检测方法，其中，所述融合蛋白包括Tn5转座酶和Fc结合蛋白，所述试剂盒包括前述融合蛋白以及其他辅助检测试剂，所述方法使用前述融合蛋白或试剂盒进行CHIP‑seq检测方法。本发明专利技术所述融合蛋白、试剂盒和方法在CHIP‑seq检测过程中能够提高建库效率，降低文库背景，从而提高CHIP‑seq检测方法的准确性并简化CHIP‑seq的实验流程。

【技术实现步骤摘要】
一种融合蛋白、试剂盒以及CHIP-seq检测方法
本专利技术涉及表观遗传学领域，具体而言，涉及一种融合蛋白、试剂盒以及CHIP-seq检测方法。
技术介绍
随着基因测序的完成以及后基因组时代的到来，表观遗传学已经成为生物领域的研究热点。表观遗传学(epigenetics)主要研究在基因核苷酸序列不发生改变的情况下，DNA及有关蛋白分子发生的可遗传修饰，这些修饰可被细胞“记忆”并在随后的细胞分裂过程中保留下来，其研究方向包括：一是基因转录水平选择性表达的调控，二是基因转录后的调控。目前，表观遗传学的热点主要集中在基因转录水平选择性表达调控上，特别是转录因子与DNA的相互作用、DNA的甲基化和组蛋白修饰等[1]。染色质免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)也称结合位点分析法，其一般流程主要包括：(1)用甲醛将DNA和结合在所述DNA上的蛋白交联，染色体分离并打碎成一定大小的片段；(2)用特异性抗体免疫沉淀并富集目标蛋白与DNA交联的复合物；(3)采用低pH值条件反交联，释放DNA片段；(4)通过对DNA片段的纯化与检测，获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。由于CHIP技术能够研究蛋白质与DNA的相互作用，其被广泛应用表观遗传学领域，用于研究转录因子与DNA的相互作用、DNA甲基化和组蛋白修饰等。随着新一代测序技术的发展，在CHIP技术的基础上发展出一种可在全基因组范围内研究蛋白质与DNA相互作用的技术——染色质免疫共沉淀-测序(即，CHIP-seq)。CHIP-seq技术包括染色质免疫共沉淀和高通量测序两部分，其中，先通过染色质免疫共沉淀技术特异性地富集目的蛋白结合的DNA，然后构建测序文库，采用新一代测序技术对富集得到的DNA片段进行高通量测序，最后通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与目标蛋白相互作用的DNA区段信息[2]。目前，一种优化的并于本技术相关的一种ChIP-seq技术叫做“CUT&RUN(CleavageUnderTargets&ReleaseUsingNuclease)”。所述CUT&RUN将ProteinA与核酸酶MNase(MicrococcalNuclease)融合，通过ProteinA能特异与免疫球蛋白G结合的特性，ProteinA将MNase引入抗体(识别特异转录因子或者组蛋白修饰的抗体)结合的位点，通过MNase的核酸内切和外切酶活性，ProteinA-MNase能特异将抗体结合的DNA两端切开，被切开的DNA片段从细胞核中释放出来，对这些DNA片段进行建库和测序分析，能在全基因组水平绘制特定蛋白与DNA相互作用图谱。其具体技术方案如图1所示：ConAbeads和细胞结合，加入识别特异转录因子的抗体，孵育一定时间，让抗体与转录因子充分结合，加入ProteinA-MNase融合蛋白，ProteinA-MNase能特异结合抗体结合的位点，然后加入Ca2+离子激活MNase核酸酶的活性，ProteinA-MNase能特异将抗体结合的DNA的两端切开，终止MNase的反应之后，这些被切开的DNA片段从细胞核中释放出来，之后对这些DNA片段进行建库和二代测序分析，根据测序结果可以在全基因组水平绘制特定转录因子的结合图谱。然而，目前通用的CHIP-seq技术存在以下缺陷：1、建库效率低，导致做少量细胞时文库信息丢失严重对ProteinA-MNase切割后释放出来的DNA片段建库时，需要采用传统的TruSeq的建库策略，建库时Adaptor和DNA片段连接效率低。尤其以少量细胞为起始材料时，DNA片段在建库过程中丢失太多，最终导致文库主要信息丢失，实验失败几率高，也无法得到全基因组水平上的蛋白与DNA相互作用图谱。2、文库背景较高ProteinA-MNase切割反应被终止后，所有小的DNA片段将从细胞核中释放出来，它们没有与转录因子或蛋白质结合。这些小片段，在建库过程中会被Adaptor连接，最后通过PCR扩增，形成高背景，降低了文库复杂度(complexity)，导致实验失败。3、现有的CHIP-seq技术无法对组织切片等进行原位检测，破坏其空间分辨率。有鉴于此，本领域亟待提出一种能够有效提高文库建立的效率、降低文库背景以及能够实现原位检测的CHIP-seq技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括Tn5转座酶和Fc结合蛋白，所述融合蛋白在CHIP-seq检测过程中能够提高建库效率，降低文库背景，从而提高CHIP-seq检测方法的准确性并简化CHIP-seq的实验流程。本专利技术的第二目的在于提供一种用于CHIP-seq的试剂盒，所述试剂盒包括前述融合蛋白和其他辅助检测试剂，能够方便、快捷地实施CHIP-seq方法，获得准确的检测结果。本专利技术的第三目的在于提供一种使用前述融合蛋白或前述试剂盒的CHIP-seq检测方法，所述方法能够提高建库效率，降低文库背景，从而提高所述检测方法的准确率和简化实验流程；进一步地，本专利技术所述方法对抗体、融合蛋白的孵育条件以及切割反应的条件进行优化，提高抗体、融合蛋白的结合效率以及DNA切割的效率和准确性，从而降低文库的背景，提高分辨率；更进一步地，本专利技术所述方法能够对组织切片、细胞涂片和细胞爬片进行原位检测，不需要裂解细胞核以及超声打断染色质，保留原样本的空间分辨率。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种融合蛋白，所述融合蛋白包括Tn5转座酶和Fc结合蛋白。本专利技术所述融合蛋白包括Tn5转座酶和Fc结合蛋白。与常规CHIP-seq方法所使用的融合蛋白proteinA-MNase相比，本专利技术所述融合蛋白不但能够准确地定位到目标蛋白与DNA相互作用的位置区域并对定位区域附近的DNA片段进行切割，而且所述Tn5转座酶在切割DNA的同时还能在被切割DNA片段的两端添加特定的Adaptors。因此，被释放的阳性DNA片段不需要额外地添加Adaptor，可以直接用于PCR扩增从而高效率地实现文库的制备，简化了CHIP-seq的实验流程。同时，由于融合蛋白本身的特性，只有被它识别并结合切割的DNA片段才能特异的带上Adaptor,而其他原因导致的释放出细胞核的背景DNA片段不能连接上Adaptor，所以在建库过程中，这些背景DNA片段将会丢失，这样被降低背景的文库具有更高的质量。总而言之，本专利技术所述融合蛋白能够提高建库效率，降低文库背景，简化实验流程，从而在整体上提高CHIP-seq检测结果的准确性，缩短实验时间。在一些具体的实施方式中，所述Fc结合蛋白选自蛋白A或蛋白G。本专利技术还涉及一种用于CHIP-seq的试剂盒，所述试剂盒包括前述的融合蛋白以及其他辅助检测试剂。本专利技术所述试剂盒能够能够方便、快捷地实施CHIP-seq方法，获得准确的检测结果。在一些具体的实施方式中，所述试剂盒包括前述的融合蛋白以及其他辅助检测试剂。在一些具体的实施方式中，所述其他辅助检测试剂包括下组中的一种或多种：洗涤缓冲液、结合缓冲液、反应缓冲液、终止缓冲液或测序用试剂。在一些具体的实施方式中，优选地，所述洗涤缓冲液包括洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2，其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括Tn5转座酶和Fc结合蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括Tn5转座酶和Fc结合蛋白。2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述Fc结合蛋白选自蛋白A或蛋白G。3.一种用于CHIP-seq的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的融合蛋白以及其他辅助检测试剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述其他辅助检测试剂包括下组中的一种或多种：洗涤缓冲液、结合缓冲液、反应缓冲液、终止缓冲液或测序用试剂；优选地，所述洗涤缓冲液包括洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2，其中，所述洗涤缓冲液1包括1～100mMHEPES、50～500mMNaCl和100～1000mM亚精胺，所述洗涤缓冲液2包括10～100mMHEPES、50～500mMNaCl、100～1000mM亚精胺和0.01～2％w.t.毛地黄皂苷；优选地，所述结合缓冲液包括10～100mMHepes、50～500mMNaCl、100～1000mM亚精胺,0.01～1％w.t.毛地黄皂苷和1～10mMEDTA；优选地，所述反应缓冲液包括10～100mMMg2+和10～100mM三羟甲基甲胺基丙磺酸；优选地，所述终止缓冲液包括10～500mMEDTA和0.1-10％w.t.SDS；优选地，所述测序用试剂包括测序用引物，更优选地，所述测序用引物为Nexteraindex引物。5.一种使用权利要求1～2任一项所述融合蛋白或权利要求3～4任一项所述试剂盒的CHIP-seq检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将样品先后分别与抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：何爱彬，艾珊珊，罗颖洁，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11