本发明专利技术涉及一种恢复衰竭免疫细胞功能的融合蛋白，其包含识别衰竭免疫细胞的功能区和激活扩增衰竭免疫细胞的功能区，两个功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接；其中，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示序列或具有类似功能的至少90％的相似序列；本发明专利技术还涉及该融合蛋白的应用。本发明专利技术所述的人工融合蛋白既能识别衰竭性免疫细胞，又能激活扩增识别的免疫细胞，恢复免疫细胞杀伤抗原阳性细胞的功能，本发明专利技术制备制备的融合蛋白与现有技术相比，其进一步改进了对CD8效应细胞的增殖效用，同时也增加了效应细胞的激活和共刺激分子的表达，能进一步增强抑制肿瘤生长和控制病毒感染的功能，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。
【技术实现步骤摘要】
一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其应用
本专利技术涉及融合蛋白
，尤其涉及一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
肿瘤的发生是由于机体细胞分裂过程中产生基因突变，突变细胞的生长失去调节控制的结果。如果肿瘤细胞不能在短期内被清除，持续的抗原刺激会逐渐造成肿瘤抗原特异性T细胞的功能性衰竭(NatureMedicine1999，5:677-685)，形成对肿瘤的耐受，免疫系统对肿瘤细胞不再敏感，造成肿瘤进一步的生长和扩散，形成癌症(PNAS.2002，99:12293-7)。由病毒感染导致慢性疾病的发生也是抗原特异性细胞衰竭的结果(TrendsImmunol.2014，35:51-60；Blood2007，109:4671-4678；CellDeathandDisease2015，6:e1694)。研究表明，大部分肿瘤侵润性淋巴细胞(TIL)和抗病毒特异性T细胞都高表达免疫抑制性受体(PNAS2010，107:7875-7880；JI2007，178:2714-2720)，处于衰竭状态，丧失了特异性识别与杀伤抗原阳性靶细胞的功能。衰竭性T细胞丧失分泌功能性细胞因子的能力，如伽马干扰素(IFNγ)等(Blood2013，121:1367-1376；J.Biomed.Biotechnol.2011，451694)。即使机体内存在大量的特异性T细胞，衰竭的免疫细胞也不能清除抗原阳性靶细胞(JImmunol2005；175:6169-6176)。在表型上，衰竭性T细胞普遍高表达的免疫抑制检查点受体包括程序性死亡受体(PD-1)，程序性死亡配体(PD-L1/L2)，T细胞免疫球蛋白3(Tim-3)，细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)和淋巴细胞活化基因3(Lag-3)等(NatImmunol.2011；12:492-9)。这些信号通路的激活会通过诱导磷酸酶抑制磷酸化反应，消弱免疫细胞活化信号，抑制T细胞的扩增，降低效应T细胞的功能，促进T细胞的凋亡，引起免疫耐受(JClinInvest.2011，121:2350-2360)。所以，激活这一类抗原特异性的免疫细胞群体，让他们重新恢复杀灭抗原阳性靶细胞的功能，才能清除肿瘤细胞或病毒感染细胞(TrendsImmunol.2015；36:265-276)，最终达到治愈的目的。抗体可以特异性地识别靶细胞表面的蛋白抗原，检查点抑制性抗体可以阻抑衰竭性细胞表面的免疫抑制性信号，例如通过PD-1抗体(Pembrolizumab和Nivolumab)与PD-1的结合防止抑制性信号的传导与激活，恢复衰竭性免疫细胞的功能，已经在临床上显示治疗癌症的临床效果，尤其是在部分患者身上得到了肿瘤完全消失和较长的临床效果持续性(NEnglJMed2012，366:2455-2465；NEnglJMed2012，366:2443-2454)。但是，对缺乏效应细胞的患者临床效果还不理想(NATURE2014，515:568-571)，而且这种T细胞的恢复持续时间短(Science2016，354:1160-1165)，患者体内的特异性免疫细胞又会很快重新回到衰竭状态(Science2016，354:1165-1169)。同时，只是阻断T细胞抑制信号不会导致免疫细胞数量的增加，而缺乏T效应细胞的患者基本上又不会产生临床效果(Nature2014，515:568-571)，所以进一步限制检查点抗体的临床治疗效果。利用白细胞生长因子治疗肿瘤具有一定的效果和不同程度的副作用(SeminOncol.2015，42:539–548)。白介素2(IL-2)的临床应用是癌症治疗第一个的免疫疗法，能彻底清除患者体内的肿瘤细胞，在部分癌症患者达到完全治愈和长期生存的效果(Cancer2008，113:293–301；JCO2005，23:133-141)。但是，细胞因子对所有表达其受体的细胞都会产生激活作用，从而可能激活非目性细胞而导致脱靶效应，临床应用会产生一系列毒副作用，限制它的临床应用(JI2014，192:5451-5458)，所以目前IL-2的临床应用范围和疗效有非常大的局限性(Immunity2013，38:13-25)。截止目前，还没有一种既能针对性地识别衰竭的肿瘤特异性T细胞，又能恢复其功能和扩增其数量的蛋白药物。因此急需开发一种能够识别并扩增特异性免疫细胞的免疫药物，来克服现有临床药物的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有临床药物的不足，提供一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其既可识别衰竭性免疫细胞，又能扩增特异性免疫细胞的数量，恢复免疫细胞的功能。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个目的是提供一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，包含识别衰竭性免疫细胞的功能区和激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区，两个功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接，从而避免两个功能区的蛋白结构相互干扰，保证融合蛋白的双功能特征，同时具有新的免疫功能功能。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术所采取的技术措施还包括：进一步地，识别衰竭性免疫细胞的功能区是利用PD-1单链抗体识别衰竭性免疫细胞表型的受体PD-1，激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区采用IL-2来激活衰竭性免疫细胞，通过非功能区连接后的融合蛋白氨基酸序列为SEQIDNO：5所示。进一步地，所述识别衰竭性免疫细胞的功能区是识别衰竭性免疫细胞的表型受体，所述衰竭性免疫细胞的表型受体是具有共抑制性功能的免疫检查点PD-1。此类受体基因在免疫细胞表面会过度表达，此信号通路的活化会导致免疫细胞的衰竭和功能丧失。进一步地，所述PD-1的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示序列(GenBank:L27440.1)。进一步地，识别所述PD-1的抗体为PD-1单链抗体，所述PD-1单链抗体的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示序列或至少90％的相似序列。进一步地，所述激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区是采用细胞因子或功能类似突变体激活性抗体来激活衰竭性免疫细胞，所述激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区采用细胞因子IL-2，所述IL-2的氨基酸系列为SEQIDNO：3所示序列(GenBank:S77834.1)或或至少90％的相似序列，其受体主要表达在T细胞和NK细胞表面。细胞因子或功能类似突变体是指在不改变其基本功能的前提下，通过氨基酸序列突变或只是利用功能区多肽，增加其对目的细胞的激活反应，减少其对非目的细胞的作用。例如，通过IL-2上氨基酸序列的改变，突变体可能降低或增加与T调节性细胞的激活，减少对非靶细胞及组织器官的作用，从而减少临床应用的副作用。进一步地，所述非功能区氨基酸片段的氨基酸序列为SEQIDNO：4所示序列，或至少90％的相似序列。进一步地，所述衰竭性免疫细胞为衰竭的特异性T细胞或衰竭的NK细胞中的至少一种。上述各氨基酸序列如下表所示：进一步地，所述融合蛋白的制备方法包括如下步骤：步骤1)由人PD-1抗体单链的C端和白介素2的N端氨基酸序列通过非功能性氨基酸片段连接，组成融合蛋白构造基因；步骤2)将步骤1)所述的融合蛋白构造基因转入真核细胞表达载体，并转染至仓鼠卵巢细胞(CHO)；步骤3)将步骤2)所述的仓鼠卵本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，包含识别衰竭性免疫细胞的功能区和激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区，两个功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接，所述识别衰竭性免疫细胞的功能区是识别衰竭性免疫细胞的表型受体，所述激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区是采用细胞因子或功能类似突变体激活性抗体来激活衰竭性免疫细胞，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示序列或具有类似功能的至少90％的相似序列。
【技术特征摘要】
1.一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，包含识别衰竭性免疫细胞的功能区和激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区，两个功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接，所述识别衰竭性免疫细胞的功能区是识别衰竭性免疫细胞的表型受体，所述激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区是采用细胞因子或功能类似突变体激活性抗体来激活衰竭性免疫细胞，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：5所示序列或具有类似功能的至少90％的相似序列。2.根据权利要求1所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述衰竭性免疫细胞的表型受体是PD-1，所述PD-1的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。3.根据权利要求2所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，用于识别所述PD-1的抗体为PD-1单链抗体，所述PD-1单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示或至少90％的相似序列。4.根据权利要求1所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述细胞因子或功能类似突变体为IL-2，所述IL-2的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示或至少90％的相似序列。5.根据权利要求1所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述非功能性氨基酸片段的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示或至...
【专利技术属性】
技术研发人员：岳喜连，邱桂华，张传能，吴国祥，
申请(专利权)人：上海科医联创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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