本发明专利技术涉及一种生产透皮肽寡肽‑1融合蛋白的制备方法。步骤包括：工程菌发酵；扩张床吸附；凝胶分离；冷冻升华干燥。有益效果：本发明专利技术利用上述方法制得的透皮肽寡肽‑1融合蛋白，具有发酵液中产物浓度高(大于500mg/L)，提取工艺简单(只需要3步层析操作，较之前工艺简化1倍)，操作成本低及纯度高(98.37％以上)，可很好的实现工业化发酵生产工艺，经济效益十分显著。
【技术实现步骤摘要】
一种生产透皮肽寡肽-1融合蛋白的制备方法
本专利技术涉及一种生产透皮肽寡肽-1融合蛋白的制备方法，属于生物工程领域。
技术介绍
EGF(EpidermalGrowthFactoy)中文名称为表皮生长因子，俗称寡肽-1，由53个氨基酸组成(并包括3个二硫键的多肽)。Montalcini和Cohen教授因为发现寡肽-1并分析其结构和作用机理，获1986年诺贝尔生理学及医学获奖。寡肽-1能刺激表皮细胞生长因子受体之酪氨酸磷酸化，达到修补增生的效果，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。最初的寡肽-1主要被应用于医学领域，对治疗烧烫伤、促进伤口愈合，修复肠胃道、肝脏及眼角膜的损伤等，功效十分显著。其后，更广泛应用于化妆品领域，寡肽-1能够深入肌肤基底层，加速细胞的增殖分化，让衰老细胞快速角化，使已断裂、变性的胶原纤维和弹性纤维得到修复，皮肤弹性增加，皱纹逐渐平复乃至消失，同时，可使面部的色斑逐渐淡化，使表皮内角质层水分保持能力增加，让肌肤滋润焕发活力。透皮肽有十几个氨基酸组成，可以穿透细胞膜。为进一步增加寡肽-1的透皮吸收性在其N端加透皮肽，可以大大增强肽-1的功效。寡肽-1是极为安全的，因为它是一种人体本身就能够产生的生物因子，在年轻的时候，人体自身能够产生足够多的寡肽-1，促使表皮细胞生长，但随着年龄的减退，寡肽-1的产生量逐步下降，因此表皮细胞的更新速度就越来越慢了。正是寡肽-1为人体本身之组成部分，故没有任何毒副作用，十分安全。使用寡肽-1护肤品，相比于一些其它的抗皱方法，安全更是卓越的优点。尽管目前已有一些寡肽-1的基因工程生产方法，但这些方法均存在着发酵液中产物浓度低，提取工艺复杂，操作成本高及收率低等缺点，至今为止，尚未有一个成熟的工业化发酵生产工艺。因此，有必要提出有效的技术方案，解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术针对上述现有技术的不足，提供一种方法简单、收率高、周期短的生产透皮肽寡肽-1融合蛋白的制备方法。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种生产透皮肽寡肽-1融合蛋白的制备方法，步骤包括：(1)工程菌发酵；(2)扩张床吸附；(3)凝胶分离；(4)冷冻升华干燥。优选地，所述工程菌发酵为：从菌种管中挑取单菌落接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到50-200mg/ml；28-32℃，150-250rpm摇床培养8-12小时，得到培养液；按1-8％接种量将所述培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在50-200mg/ml，28-32℃，150-250rpm摇床培养8-12小时，再按1-8％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，29-31℃，160-240rpm，PH值维持7.0，培养9-11小时，然后温度诱导，继续培养2-8小时，得到发酵液。优选地，所述扩张床吸附为：用冷冻离心机将所述发酵液于2-4℃条件下以6000-12000rpm的速度离心10-30min，弃上清液保留沉淀于2-4℃条件下保存备用；取适量沉淀，用10倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，700-1800w超声处理10-28个循环，每个循环35min，再用冷冻离心机将缓冲液与2-18℃条件下以6000-12000rpm的速度离心10-30min，弃上清液；用5倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，用高压均质机处理1-5遍，再用冷冻离心机将缓冲液于2-4℃条件下以6000-12000rpm的速度离心5-30min，弃上清液，取沉淀用15-45倍裂解液溶解，6000-12000rpm的速度离心30min，收集上清液，用层析系统将100-800ml的该上清液以1.5-8.5ml/min速度加入source30Q扩张床中，用20mMTris缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含1M氯化钠20mMTris缓冲液以7％比例洗脱，收集含透皮肽寡肽-1融合蛋白的洗脱峰；再将洗脱峰液用复性液复性，用层析系统将1500-3500ml的复性液液以4-10ml/min速度加入source30Q扩张床中，用15mM精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含0.75M氯化钠15mM精氨酸缓冲液以10％比例洗脱，收集含透皮肽寡肽-1融合蛋白的洗脱峰，洗脱液于2-18℃条件下保存备用。优选地，所述凝胶分离为：用层析系统将15-30ml所述洗脱液以4-8ml/min的速度加到Superdex30凝胶层析柱中，然后将15mM精氨酸缓冲液以4-8ml/min的速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测检测仪在波长280nm下进行检测，收集保留吸收峰，收集体积为220-280ml。优选地，所述冷冻升华干燥为：将收集液加入冻干保护剂，于-35℃至-42℃下冷冻升华干燥，得白色干粉状透皮肽寡肽-1融合蛋白。有益效果：本专利技术利用上述方法制得的透皮肽寡肽-1融合蛋白，具有发酵液中产物浓度高(大于500mg/L)，提取工艺简单(只需要3步层析操作，较之前工艺简化1倍)，操作成本低及纯度高(98.37％以上)，可很好的实现工业化发酵生产工艺，经济效益十分显著。具体实施方式实施例一：(1)工程菌发酵：从-70℃保存的菌种管中挑取单菌落接入5-15ml种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到50-200mg/ml，28-32℃，150-250rpm摇床培养8-12小时，按1-8％接种量将前面的培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在50-200mg/ml，28-32℃，150-250rpm摇床培养8-12小时，再按1-8％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，29-31℃，160-240rpm，PH值维持7.0，培养9-11小时，然后温度诱导，继续培养2-8小时。透皮肽寡肽-1融合蛋白表达于菌种中。(2)扩张床吸附：用冷冻离心机将所述发酵液于2-4℃条件下以6000-12000rpm的速度离心10-30min，弃上清液保留沉淀于2-4℃条件下保存备用；取适量沉淀，用10倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，700-1800w超声处理10-28个循环，每个循环35min，再用冷冻离心机将缓冲液与2-18℃条件下以6000-12000rpm的速度离心10-30min，弃上清液；用5倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，用高压均质机处理1-5遍，再用冷冻离心机将缓冲液于2-4℃条件下以6000-12000rpm的速度离心5-30min，弃上清液，取沉淀用15-45倍裂解液溶解，6000-12000rpm的速度离心30min，收集上清液，用层析系统将100-800ml的该上清液以1.5-8.5ml/min速度加入source30Q扩张床中，用20mMTris缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含1M氯化钠20mMTris缓冲液以7％比例洗脱，收集含透皮肽寡肽-1融合蛋白的洗脱峰；再将洗脱峰液用复性液复性，用层析系统将1500-3500ml的复性液液以4-10ml/min速度加入source30Q扩张床中，用15mM精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含0.75M氯化钠15mM精氨酸缓冲液以10％比例洗脱，收集含透皮肽寡肽-1融合本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产透皮肽寡肽‑1融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤包括：(1)工程菌发酵；(2)扩张床吸附；(3)凝胶分离；(4)冷冻升华干燥。
【技术特征摘要】
1.一种生产透皮肽寡肽-1融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤包括：(1)工程菌发酵；(2)扩张床吸附；(3)凝胶分离；(4)冷冻升华干燥。2.如权利要求1所述的生产透皮肽寡肽-1融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述工程菌发酵为：从菌种管中挑取单菌落接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到50-200mg/ml；28-32℃，150-250rpm摇床培养8-12小时，得到培养液；按1-8％接种量将所述培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在50-200mg/ml，28-32℃，150-250rpm摇床培养8-12小时，再按1-8％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，29-31℃，160-240rpm，PH值维持7.0，培养9-11小时，然后温度诱导，继续培养2-8小时，得到发酵液。3.如权利要求2所述的生产透皮肽寡肽-1融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述扩张床吸附为：用冷冻离心机将所述发酵液于2-4℃条件下以6000-12000rpm的速度离心10-30min，弃上清液保留沉淀于2-4℃条件下保存备用；取适量沉淀，用10倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，700-1800w超声处理10-28个循环，每个循环35min，再用冷冻离心机将缓冲液与2-18℃条件下以6000-12000rpm的速度离心10-30min，弃上清液；用5倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，用高压均质机处理1-5遍，再用冷冻离心机将缓冲液于2-4℃条件下以6000...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄赫，薛涛，孙韵，
申请(专利权)人：烟台康达尔药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37
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