HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了HA介导CPPs修饰的载10‑HCPT相变脂质纳米粒，包括磷脂壳膜,磷脂壳膜上载有抗肿瘤药物10‑HCPT，磷脂壳膜上修饰有DC‑胆固醇、两侧连有半胱氨酸的穿膜肽，磷脂壳膜外层吸附有透明质酸。本发明专利技术要解决的技术问题是提供一种能特异性主动靶向并进入深部肝癌组织，在体外LIFU的辐照下能发生液‑气相转变，可同时起到实时显像和定位释放抗肿瘤药物的HA介导CPPs修饰的载10‑HCPT相变脂质纳米粒的制备方法。

HA mediated CPPs modified 10-HCPT loaded phase change lipid nanoparticles and preparation method thereof

The invention discloses a HA mediated CPPs modified HCPT modified lipid nanoparticles, including a phospholipid shell membrane, a phospholipid shell containing an anticancer drug 10 HCPT, a phospholipid shell containing DC cholesterol, a membrane peptide with cysteine on both sides, and a phosphatidic acid on the outer layer of the phospholipid shell membrane. The technical problem to be solved is to provide a kind of specific active target and enter deep liver cancer tissue, which can generate liquid gas phase transformation under the irradiation of LIFU in vitro, and can simultaneously play the real-time imaging and locate the release of the anti tumor drug HA mediated CPPs modified HCPT phase variable lipid nanoparticles.

【技术实现步骤摘要】
HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒及其制备方法
本专利技术涉及超声影像领域，具体涉及HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的制备方法及其应用。
技术介绍
肝细胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是发病率第五位、死亡率第三位的恶性肿瘤，极大的危害着患者的身心健康。目前HCC最佳的治疗方法仍为根治性手术切除，但大多数HCC患者确诊时已达晚期或存在远处转移，治疗棘手，预后很差。由于原发性肝癌对现有的全身化疗药物敏感性较差，其化疗效果不佳。因此，急需探索治疗原发性肝癌的新靶点、新措施和开发新药物。超声微泡作为超声造影剂已广泛应用于临床疾病的诊断，尤其在肝脏疾病的诊断和鉴别诊断中发挥重要作用，另外，它作为一种携带抗肿瘤药物或基因的工具用于疾病的治疗也广泛应用于实验研究，但超声微泡因其粒径大，不能穿过肿瘤组织内部血管内皮间隙(380～780nm)，难以实现血管外肿瘤组织的显像和治疗。为了解决这个难题，脂质纳米粒以纳米级粒径能穿透肿瘤组织血管内皮间隙到达肿瘤组织，同时也可作为抗肿瘤药物载体将化疗药物运输到肿瘤部位进行抗癌治疗，但常规脂质纳米粒以聚集形式增强背向散射显影，其显像效果不及超声微泡。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种能特异性主动靶向并进入深部肝癌组织，在体外LIFU的辐照下能发生液-气相转变，可同时起到实时显像和定位释放抗肿瘤药物的HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒，包括磷脂壳膜,磷脂壳膜上载有抗肿瘤药物10-HCPT，磷脂壳膜上修饰有DC-胆固醇、两侧连有半胱氨酸的穿膜肽，磷脂壳膜外层吸附有透明质酸。进一步，所述的磷脂壳膜内部包裹有全氟戊烷。进一步，其粒径为(284.2±13.3)nm，粒径多分散指数PDI为0.149。进一步，其ZETA电位为-(16.55±1.50)mV。进一步，其载抗肿瘤药物量为(5.23±0.34)％，包封率为(48.10±3.13)％。采用本专利技术的HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒，简称HA/CPPs-10-HCPT-NPs，该纳米粒在光镜、激光共聚焦显微镜和透射电镜下观察呈大小均匀的颗粒状，分散性好，无明显成团聚集现象，粒径为表面zeta电位为-(16.55±1.50)mV，表面电荷为负电荷，使其在体内血液循环中不易受血液中的蛋白攻击，延长了体内循环时间，同时粒径大小为(284.2±13.3)nm，具备穿透血管内皮间隙(380～780nm)的能力，能到达血管外组织细胞，具备让血池外组织细胞成像的潜力。通过高效液相色谱仪检测HA/CPPs-10-HCPT-NPs中10-HCPT的载药量和包封率分别为(5.23±0.34)％and(48.10±3.13)％。本专利技术制备纳米粒的壳材磷脂与生物体细胞膜磷脂成分相同；同时选用的全氟戊烷(PFP)具备良好的携氧能力，可作为血液替代品；透明质酸是一种天然的高分子酸性粘多糖，具有生物相容性、生无可降解性、无免疫源性以及对肿瘤细胞的高亲和性等特点，已在药物输送和组织工程等领域得到广泛的应用。因此本专利技术制备纳米粒的所用材料生物安全性均较高。PFP的沸点为29℃，在常温条件下呈液态，当在生理温度(37℃)条件下可相变呈气态，研究表明，当PFP被脂质包裹形成纳米粒后其液气相变温度阈值会明显升高，这是因为施加在纳米粒周围的Laplace压力较前增加了，从HA/CPPs-10-HCPT-NPs热致相变实验结果，可以看到加热板温度升至43℃时尚没能使其相变，当升至45℃时，开始有气泡形成，表明HA/CPPs-10-HCPT-NPs相变温度为45℃左右，温度升至47℃时，形成的气泡数量最多，随着加热板温度的继续升高，纳米粒体积增大至一定程度后会发生爆破。超声是触发液态氟碳相变的最有效因素之一。本专利技术也对HA/CPPs-10-HCPT-NPs进行了声致相变(ADV)条件探索，我们从实验结果看到新研制的HA/CPPs-10-HCPT-NPs在2.4W/cm23min时B-mode和CEUS显示超声声像图回声信号最强，DFY定量分析软件结果也提示在2.4W/cm23min时回声强度值最高，因此HA/CPPs-10-HCPT-NPs最佳ADV条件为2.4W/cm23min，之所以在2.8W/cm23min时的超声回声强度较2.4W/cm23min时弱，考虑原因可能是在2.8W/cm23min时足以让纳米粒发生破裂，导致回声强度明显下降。综上所述，本专利技术的纳米级超声分子探针HA/CPPs-10-HCPT-NPs具备粒径小、良好载药能力、ADV等优秀性能，具备良好的靶向穿膜能力，将HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU辐照物理化学协同作用起到很好的杀伤肝癌细胞的效果。本专利技术还提供另一个技术方案，HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的制备方法，采用薄膜分散法和超声乳化法。进一步，薄膜分散法的操作为A.DSPE-CG-TAT-GC的合成其操作步骤如下：1)DSPE-PEG-NHS的合成(a)称取磷脂-聚乙二醇-羧基溶于二氯甲烷，按1:3:2.5摩尔比加入N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺，在37.5℃搅拌反应12小时；(b)反应完成后过滤，用无水乙醚进行洗涤后过滤，复溶后反向层析纯化，真空干燥，得到DSPE-PEG-NHS；2)DSPE-CG-TAT-GC的合成(a)分别将DSPE-PEG-NHS和两侧连有半胱氨酸的穿膜肽溶于二甲基亚砜，向两侧连有半胱氨酸的穿膜肽加入等摩尔比的三乙胺，20mM巯基乙醇；(b)将CG-TAT-GC加入到DSPE-PEG-NHS中，搅拌反应2小时，加入三倍体积的水稀释，调pH2～3终止反应；(c)透析过夜，反向层析纯化后，冷冻干燥得DSPE-CG-TAT-GC；超声乳化法的操作为B.HA/CPPs-10-HCPT-NPs的制备，其操作步骤为(1)称量：称取10mg二棕榈酰磷脂酰胆碱，2mgDSPE-CG-TAT-GC，1.5mgDC-胆固醇，1mg抗肿瘤药物10-HCPT原药粉末；(2)溶解：加入10ml甲醇和10ml三氯甲烷溶解；(3)旋转蒸发：使用旋转蒸发器去除有机溶剂，旋转蒸发时间为1h，得到药脂薄膜；(4)水化：加入4ml去离子水，将药脂薄膜洗脱下来，得到药脂混悬液；(5)声振：将药脂混悬液预冷，然后缓慢加入120μl全氟戊烷至药脂混悬液中，使用声振仪声振乳化，得到乳白色液体；(6)离心：将乳白色液体高速离心，离心转速为8000rpm，温度为4℃，时间为5min，离心完毕去弃上清液，用去离子水重悬沉淀，如此重复两次，获得CPPs-10-HCPT-NPs混悬液；(7)配置透明质酸溶液：将6mg透明质酸钠中加入10ml去离子水，溶解后配制成0.6mg/ml透明质酸溶液；(8)静电吸附：将CPPs/10-HCPT-NPs混悬液与0.6mg/ml透明质酸溶液等体积混合，静置1h后，得到HA/CPPs-10-HCPT-NPs乳液。进一步，所述步骤B的(3)旋转蒸发时，温度为50℃。进一步，所述步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.HA介导CPPs修饰的载10‑HCPT相变脂质纳米粒，包括磷脂壳膜,其特征在于：磷脂壳膜上载有抗肿瘤药物10‑HCPT，磷脂壳膜上修饰有DC‑胆固醇、两侧连有半胱氨酸的穿膜肽，磷脂壳膜外层吸附有透明质酸。

【技术特征摘要】
1.HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒，包括磷脂壳膜,其特征在于：磷脂壳膜上载有抗肿瘤药物10-HCPT，磷脂壳膜上修饰有DC-胆固醇、两侧连有半胱氨酸的穿膜肽，磷脂壳膜外层吸附有透明质酸。2.根据权利要求1所述的HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒，其特征在于：所述的磷脂壳膜内部包裹有全氟戊烷。3.根据权利要求2所述的HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒，其特征在于：其粒径为(284.2±13.3)nm，粒径多分散指数PDI为0.149。4.根据权利要求3所述的HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒，其特征在于：其ZETA电位为-(16.55±1.50)mV。5.根据权利要求4所述的HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒，其特征在于：其载抗肿瘤药物量为(5.23±0.34)，其全氟正戊烷包封率为(48.10±3.13)％。6.HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的制备方法，其特征在于：采用薄膜分散法和超声乳化法。7.根据权利要求6所述的HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的制备方法，其特征在于：薄膜分散法的操作为A.DSPE-CG-TAT-GC的合成其操作步骤如下：1)DSPE-PEG-NHS的合成(a)称取磷脂-聚乙二醇-羧基溶于二氯甲烷，按1:3:2.5摩尔比加入N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺，在37.5℃搅拌反应12小时；(b)反应完成后过滤，用无水乙醚进行洗涤后过滤，复溶后反向层析纯化，真空干燥，得到DSPE-PEG-NHS；2)DSPE-CG-TAT-GC的合成(a)分别将DSPE-PEG-NHS和两侧连有半胱氨酸的穿膜肽溶于二甲基亚砜，向两侧连有半胱氨酸的穿膜肽加入等摩尔比的三乙胺，20mM巯基乙醇；(b)将CG-TAT-GC加入到DSPE-PEG-NHS中，搅拌反应2小时，加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：任建丽，周志益，赵红雲，朱蕾蕾，王志刚，冉海涛，李攀，孙阳，郝兰，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50