一种纳米颗粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及医药技术领域，特别涉及一种纳米颗粒及其制备方法和应用，所述纳米颗粒以层状双羟基复合金属氧化物作为载体，所述载体负载小干扰RNA和抗原表位肽，其中，所述小干扰RNA插入载体中，抗原表位肽吸附在所述载体表面。本发明专利技术纳米颗粒能够共递送吲哚胺2,3‑双加氧酶小干扰RNA和酪氨酸酶相关抗原肽2的水滑石纳米颗粒，该颗粒具有靶向DC细胞，打破免疫耐受，激活免疫系统，并引起较强的细胞免疫反应的功能，相对于单独使用基于肿瘤抗原特异性表位Trp2的疫苗或IDO‑siRNA，对于黑色素瘤生长的抑制效果显著增强。

Nano particles and their preparation methods and Applications

The invention relates to the medical technology field, in particular to a nano particle and a preparation method and application of the nanoparticle with layered double hydroxyl complex metal oxide as carrier, the carrier is loaded with small interference RNA and epitope peptide, in which the antigen epitope peptide is adsorbed in the carrier of the small interference RNA insertion body. The surface of the body. The nanoparticles can deliver a total of indolamine 2,3 dioxygenase small interference RNA and tyrosinase related antigen peptide 2 nanoparticles, which have targeted DC cells, break immune tolerance, activate the immune system, and cause strong cellular immune response, compared to the use of tumor antigen based specific antigen alone. The vaccine against Trp2 epitope or IDO siRNA can significantly enhance the inhibitory effect on melanoma growth.

【技术实现步骤摘要】
一种纳米颗粒及其制备方法和应用
本专利技术涉及医药
，特别涉及一种纳米颗粒及其制备方法和应用，具体涉及共递送小干扰RNA和肿瘤相关抗原表位的水滑石纳米颗粒的制备及其应用。
技术介绍
酪氨酸酶相关抗原肽2(Trp2)是一种肿瘤特异性抗原表位，通过将其制备成疫苗可以有效抑制黑色素瘤的生长。Trp2是由9个氨基酸组成的小分子多肽，序列短，免疫原性弱，难以引起有效的毒性T细胞反应。因此通常使用载体来加强Trp2的免疫原性。树突状细胞中IDO基因的过表达可导致其下游产物IL-12和TGF-β水平的升高，这些细胞因子是造成机体免疫耐受的重要因素。吲哚胺2,3-双加氧酶小干扰RNA(IDOsiRNA)与IDO基因转录产物mRNA相互作用可使靶细胞中IDO基因沉默。通过靶向递送IDOsiRNA至树突状细胞，使细胞中IDO基因沉默，可以在一定程度上打破机体免疫耐受，激活细胞免疫系统，抑制肿瘤生长。用于上述药物靶向递送的载体包括脂质体，阳离子纳米颗粒等。“Q.Zeng,H.Jiang,T.Wang,Z.Zhang,T.Gong,X.Sun,CationicmicelledeliveryofTrp2peptideforefficientlymphaticdrainingandenhancedcytotoxicT-lymphocyteresponses,Journalofcontrolledrelease200(2015)1-12.”Zeng等人应用聚乙烯亚胺/硬脂酸阳离子复合纳米颗粒包埋Trp2制备得到纳米颗粒疫苗，可有效抑制黑色素瘤的生长。“D.Chen,J.Koropatnick,TargetedsiRNASilencingofIndoleamine2,3-DioxygenaseinAntigen-presentingCellsUsingMannose-conjugatedLiposomes:ANovelStrategyforTreatmentofMelanoma.,JImmunother37(2014)123-134.”Chen等人利用甘露糖修饰的脂质体包埋IDO-siRNA制备的纳米颗粒，可靶向递送至树突状细胞。这些载体均存在制备成本高，大规模生产困难或生物毒性较大等缺点。廉价、易制备、生物相容性高的疫苗载体则具有较好的应用前景。近年来，应用层状双羟基复合金属氧化物(LDH，水滑石)进行生物药物递送的研究得到了广泛关注。LDH带有正电荷，具有高的比表面积，具有内涵体逃逸能力，较好的离子交换能力和层间阴离子可交换性等特性。携带负电荷的生物分子，如RNA在一定条件下通过插层的方式进入LDH层间，但对颗粒表面电荷性质影响较小，从而使LDH纳米颗粒仍然具有在颗粒表面吸附负电荷分子的能力，为构建IDO-siRNA和Trp2共递送纳米颗粒提供了结构基础。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种纳米颗粒及其制备方法和应用，具体涉及共递送小干扰RNA和肿瘤相关抗原表位的水滑石纳米颗粒的制备及其应用，所述纳米颗粒是一种兼有打破肿瘤免疫耐受与肿瘤抗原免疫特性的复合型肿瘤免疫治疗制剂。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种纳米颗粒，以层状双羟基复合金属氧化物作为载体，所述载体负载小干扰RNA和抗原表位肽，其中，所述小干扰RNA插入载体中，抗原表位肽吸附在所述载体表面。本专利技术中，所述纳米颗粒化学式为抗原表位肽/LDH/IDO-siRNA，游离的抗原表位肽或IDO-siRNA在体内不稳定易降解，且难以被细胞有效吞噬，通过使用所述纳米颗粒，抗原表位肽和IDO-siRNA可同时被呈递至细胞内发挥协同作用，其具体机制如下：所述纳米颗粒经网格蛋白介导途径被树突状细胞吞噬后形成内涵体，在内涵体酸化过程中，水滑石发生溶解，随后细胞内离子浓度升高，水分子内流从而导致内涵体破裂。同时，由水滑石所负载的IDO-siRNA与抗原表位肽在内涵体中释放，当内涵体破裂时，这些药物同时进入细胞质中产生协同作用：一方面，IDO-siRNA通过作用于IDOmRNA沉默树突状细胞中IDO基因的表达，抑制由IDO基因过表达导致的树突状细胞向免疫耐受性细胞的分化，从而有效提呈抗原表位并促进T细胞增殖活化；另一方面，肿瘤抗原表位进入细胞质中与MHCI类分子结合并被提呈至细胞表面，激发Th1免疫反应的产生。简单来说，IDO-siRNA维持树突状细胞提呈肿瘤抗原表位的功能，抑制免疫耐受的发生，从而确保肿瘤抗原表位得以提呈并激活细胞免疫。根据本专利技术，所述小干扰RNA(IDO-siRNA)为吲哚胺2,3-双加氧酶小干扰RNA。优选地，所述小干扰RNA正义链如SEQIDNO.1所示，所述小干扰RNA反义链如SEQIDNO.2所示。核酸序列如下：正义链(SEQIDNO.1)：5’-GGGCUUCUUCCUCGUCUCUTT-3’；反义链(SEQIDNO.2)：5’-AGAGACGAGGAAGAAGCCCTT-3’.优选地，所述抗原表位肽为酪氨酸酶抗原表位肽、Melan-A/MART-1抗原表位肽、gp100抗原表位肽、鸡卵白蛋白、HER-2/neu肿瘤相关抗原或MUC1抗原肽中的任意一种或至少两种的组合。本专利技术中，所述酪氨酸酶抗原表位肽、Melan-A/MART-1抗原表位肽、gp100抗原表位肽、鸡卵白蛋白这几个抗原表位肽主要针对黑色素瘤，所述HER-2/neu肿瘤相关抗原和MUC1抗原肽主要针对乳腺癌。优选地，所述酪氨酸酶抗原表位肽的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述氨基酸序列(SEQIDNO.3)为SVYDFFVWL.第二方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：(1)制备双羟基复合金属氧化物；(2)将步骤(1)制备得到的双羟基复合金属氧化物载体与小干扰RNA混合，混合后静置，得到含有小干扰RNA插层的纳米颗粒；(3)将步骤(2)制备得到的含有小干扰RNA插层的纳米颗粒与抗原表位肽混合，混合后静置，离心得到所述含有小干扰RNA和抗原表位肽的纳米颗粒。根据本专利技术，步骤(1)所述的制备双羟基复合金属氧化物为本领域的常规技术手段，本领域技术人员可以根据需要调整合成的各个条件，本专利技术的制备双羟基复合金属氧化物包括如下具体步骤：将摩尔浓度为0.01-0.1M，优选为0.03M的硝酸镁和摩尔浓度为0.01-0.1M，优选为0.01M的硝酸铝混合后加入摩尔浓度为0.01-0.1M，优选为0.15M的氢氧化钠溶液中，搅拌10-20min，优选15min，12000离心1-10min，优选5min，用去碳酸水30℃震荡混匀20-35min，优选30min，转至透析袋透析1-10h，优选5h，再转移到密闭容器中30℃，100-400rpm，优选为280rpm震荡混悬0.5-3h，优选1h，移至聚四氟乙烯水热釜中100-130℃，优选120℃恒温10-20h，优选为15h，自然冷却得到双羟基复合金属氧化物。优选为，制备双羟基复合金属氧化物包括如下具体步骤：将10mL0.03M硝酸镁与0.01M硝酸铝混合液快速加入40mL0.15MNaOH溶液中，室温下快速搅拌15min后，在12000g下离心5min。所得产物用去碳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳米颗粒，其特征在于，以层状双羟基复合金属氧化物作为载体，所述载体负载小干扰RNA和抗原表位肽，其中，所述小干扰RNA插入载体中，抗原表位肽吸附在所述载体表面。

【技术特征摘要】
1.一种纳米颗粒，其特征在于，以层状双羟基复合金属氧化物作为载体，所述载体负载小干扰RNA和抗原表位肽，其中，所述小干扰RNA插入载体中，抗原表位肽吸附在所述载体表面。2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述小干扰RNA为吲哚胺2,3-双加氧酶小干扰RNA；优选地，所述小干扰RNA正义链如SEQIDNO.1所示，所述小干扰RNA反义链如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1或2所述的纳米颗粒，其特征在于，所述抗原表位肽为酪氨酸酶抗原表位肽、Melan-A/MART-1抗原表位肽、gp100抗原表位肽、鸡卵白蛋白、HER-2/neu肿瘤相关抗原或MUC1抗原肽中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述酪氨酸酶抗原表位肽的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。4.一种如权利要求1-3中任一项所述的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备双羟基复合金属氧化物；(2)将步骤(1)制备得到的双羟基复合金属氧化物载体与小干扰RNA混合，混合后静置，得到含有小干扰RNA插层的纳米颗粒；(3)将步骤(2)制备得到的含有小干扰RNA插层的纳米颗粒与抗原表位肽混合，混合后静置，离心得到所述含有小干扰RNA和抗原表位肽的纳米颗粒。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的制备双羟基复合金属氧化物包括如下具体步骤：将摩尔浓度为0.01-0.1M，优选为0.03M的硝酸镁和摩尔浓度为0.01-0.1M，优选为0.01M的硝酸铝混合后加入摩尔浓度为0.01-0.1M，优选为0.15M的氢氧化钠溶液中，搅拌10-20min，优选15min，12000离心1-10min，优选5min，用去碳酸水30℃震荡混匀20-35min，优选30min，转至透析袋透析1-10h，优选5h，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘瑞田，张凌宵，刘栋群，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11