文冠果种壳提取物及其在治疗和/或预防多发性硬化药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种文冠果种壳提取物的制备方法，该方法将文冠果种壳先进行甲醇水溶液萃取提取，再加入盐酸进行酸化并过滤，最后用乙酸乙酯萃取，减压下蒸发得到文冠果种壳提取物。硅烷化衍生后经GC‑MS测定组成及含量，该文冠果种壳提取物中有20种酚类化合物，占文冠果种壳提取物的84.62％。主要成分为咖啡酸(20.05％)，对羟基苯乙酸(9.32％)，对香豆酸(8.84％)和邻羟基肉桂酸(8.29％)。经整体动物模型实验研究表明，口服该文冠果种壳提取物对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的神经功能评分有显著的改善作用，减轻了中枢神经系统的炎症和脱髓鞘程度，可用于制备治疗和/或预防多发性硬化疾病的药物。

Xanthoceras sorbifolia seed shell extract and its application in treatment and / or prevention of multiple sclerosis drugs

The invention discloses a preparation method of the extract of the seed shell of Xanthoceras. The method extracts the seed shell of the Chinese crown fruit first and extracts the extract of the methanol water solution, then adds hydrochloric acid to acidification and filtration, and then extracts with ethyl acetate and evaporates under the decompression to get the seed shell extract of Xanthoceras. Silane derivatization was used to determine the composition and content of the Xanthoceras sorbifolia seed shell extract by GC MS. It contained 20 phenolic compounds, accounting for 84.62% of the Xanthoceras sorbifolia shell extract. The main ingredients were caffeic acid (20.05%), hydroxyphenylacetic acid (9.32%), coumaric acid (8.84%) and ortho hydroxycinnamic acid (8.29%). The experimental study of the whole animal model showed that the oral extract of the orally orally can significantly improve the neural function score of experimental autoimmune encephalomyelitis, reduce the degree of inflammation and demyelination in the central nervous system, and can be used to prepare drugs for the treatment and / or prevention of multiple sclerosis.

【技术实现步骤摘要】
文冠果种壳提取物及其在治疗和/或预防多发性硬化药物中的应用
本专利技术属于化合物提取及其医药应用
，涉及文冠果种壳活性物质的提取方法及其产品和应用，特别涉及文冠果种壳提取物及其在治疗和/或预防多发性硬化药物中的应用。
技术介绍
文冠果(拉丁学名XanthocerassorbifoliaBunge)，又称文冠木、文官果、土木瓜、木瓜、温旦革子。属无患子科、落叶灌木或小乔木植物，是我国特有的一种优良木本食用油料树种。分布于东北和华北及陕西、甘肃、宁夏、安徽、河南等地，寿命超过200年。该物种的性味及功效为甘，平，祛风除湿。传统上用于治疗动脉硬化，高脂血症，风湿病，慢性肝炎，夜间遗尿症和痢疾。此外，文冠果是一种经济和药学上重要的能源作物，其种子中的油含量超过50％，不仅作为营养坚果，而且还用于生产食用油和生物燃料。目前，人们对种子的植物油生产都十分关注，同时产生大量无用残渣，包括坚果壳和种子粉。文冠果果实和种子的化学研究表明，它们含有多种化合物，包括类黄酮，三萜类化合物和甾醇。多发性硬化症(MultipleSclerosis，MS)及其动物模型，实验性自身免疫性脑脊髓炎(ExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis，EAE)是一种由自身异常激活的免疫细胞作用于中枢神经系统，造成的以炎性细胞浸润和髓鞘脱失为典型特征的神经退行性疾病，损害身体和认知能力，最终导致死亡。尽管多发性硬化症的发病机制尚未完全阐明，但通常认为由自身异常激活的CD4+T细胞促进了MS和EAE中CNS的组织损伤。在这些CD4+T细胞中，分泌IL-17，IL-22和GM-CSF的Th17细胞被认为是诱导自身免疫和炎症的主要亚型之一。长期以来，来自药用和食用植物的天然化合物及其衍生物被认为是新型治疗剂的丰富来源。例如，2010年批准的第一个口服MS治疗药物芬戈莫德(FTY720)是一种广泛使用的药用植物冬虫夏草(CordycepsSinensis)的天然产物的衍生物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种文冠果种壳提取物及其在治疗和/或预防多发性硬化药物中的应用，通过将文冠果种壳提取物衍生化，再经GC-MS测定其成分，得到关于文冠果果壳提取物体内抗炎活性结果，可作为一种替代的新来源，用于食品和制药行业，特别是在治疗脱髓鞘疾病药物方面的应用。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：一种文冠果种壳提取物的制备方法，其特征在于，将文冠果种壳先进行甲醇水溶液萃取提取，再加入HCl进行酸化并过滤；最后用乙酸乙酯萃取，减压下蒸发得到文冠果种壳提取物，硅烷化衍生后，经GC-MS成分测定衍生物，该文冠果种壳提取物中有20种酚类化合物，占文冠果种壳提取物的84.62％，主要酚类化合物为咖啡酸，占20.05％，对羟基苯乙酸，占9.32％，对香豆酸，占8.84％，和邻羟基肉桂酸，占8.29％。上述文冠果种壳提取物的制备方法，依次按如下步骤制备：(1)取文冠果种壳，粉碎，干燥，得到粉末；(2)取所述粉末，脱脂，用体积百分比为70％的甲醇水溶液进行提取，得到提取液，所述的甲醇水溶液内每升含有1.0g的BHT；(3)取所述提取液，加入6M的HCl并搅拌，得到混合物；(4)用磁力搅拌器将混合物在35℃加热16小时，待溶液冷却，然后过滤；(5)用乙酸乙酯萃取混合物，得到乙酸乙酯提取物；(6)取乙酸乙酯提取物，并在旋转蒸发器上在35℃减压下蒸发至干，取所述有机相，得到文冠果种壳提取物，溶解于吡啶溶液后，用TMCS和BSTFA在80℃加热45分钟进行硅烷化衍生，再经GC-MS测定衍生物的组成及含量，该文冠果种壳提取物中有20种酚类化合物，占文冠果种壳提取物的84.62％，主要酚类化合物为咖啡酸，占20.05％，对羟基苯乙酸，占9.32％，对香豆酸，占8.84％，和邻羟基肉桂酸，占8.29％。根据本专利技术，步骤(2)中，所述粉末与所述体积百分比为70％的甲醇水溶液的配比为：1重量份粉末：8-15重量份甲醇水溶液。所述步骤(3)中，所述提取液与加入6M的HCl的体积配比为1：4。所述步骤(5)中提取液每次用10ml乙酸乙酯萃取混合物，且萃取三次，合并得到提取液。进一步地，所述的GC-MS成分测定衍生物的方法是：(1)取文冠果种壳提取物10μg溶解在100μl新鲜蒸馏的吡啶中；(2)取上述吡啶溶液10μL加入三甲基氯硅烷(TMCS)和N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)的混合物，在密闭管中涡旋混合，得到混合物；(3)取上述混合物放置在80℃的水浴中45分钟，得到甲硅烷基化的衍生混合物，取1μl衍生混合物用GC-MS分析。所述三甲基甲硅烷基(TMCS)由于对水分具有高敏感性，因此在制备和衍生过程中应确保无水条件。根据申请人的实验表明，所制备的文冠果种壳提取物，能够应用于制备治疗和/或预防多发性硬化药物。所述的治疗和/或预防多发性硬化药物是治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物。本专利技术的制备方法所制备的文冠果种壳提取物是一种含酚类成分，通过衍生化和GC-MS分析，共鉴定出20种酚类化合物，占文冠果种壳提取物的84.62％。主要化合物为咖啡酸(20.05％)，对羟基苯乙酸(9.32％)，对香豆酸(8.84％)和邻羟基肉桂酸(8.29％)。经整体动物模型实验研究表明，口服文冠果种壳提取物对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的神经功能评分有显著的改善作用，减轻了中枢神经系统的炎症和脱髓鞘程度，同时对CNS炎症细胞浸润有明显的抑制作用，并发现文冠果种壳提取物诱导的作用机制涉及减少致病性免疫细胞渗入中枢神经系统，抑制促炎因子和趋化因子的表达，并且通过JAK/STAT途径抑制辅助性T细胞Th1和Th17的分化，可用于制备防治/治疗多发性硬化疾病的药物。附图说明图1为文冠果种壳提取物(NE)成分测定的GC-MS色谱图。图2为本专利技术中PBS对照组与文冠果种壳提取物(NE)预防组三个浓度，小鼠发病情况及体重情况对比。图3为本专利技术中PBS对照组分别与两个同一浓度不同给药时间的文冠果种壳提取物(NE)治疗组小鼠发病情况对比。图4为PBS对照组与文冠果种壳提取物(NE)治疗组第30天脊髓腰骶膨大病理切片图。图5为正常小鼠、PBS对照组与文冠果种壳提取物(NE)治疗组CNS中炎性细胞数量对比图。图6实时定量PCR检测PBS对照组与文冠果种壳提取物(NE)治疗组相关细胞因子基因表达图。图7为流式细胞结果图。PBS对照组与文冠果种壳提取物(NE)治疗组的有关脾脏或中枢神经细胞CD4+和CD8+细胞表面染色和炎性因子的检测结果。图8为文冠果种壳提取物(NE)治疗组与PBS对照组相比，CNS和脾脏中CD4+和CD8+T细胞的百分比和绝对数量显着降低图。图9为Elisa分析，测定了文冠果种壳提取物(NE)治疗组与PBS对照组的脾细胞培养中上层清液细胞因子表达水平图。图10为免疫印迹分析，从文冠果种壳提取物(NE)治疗组或PBS对照组小鼠纯化的脾CD4+T细胞获得蛋白质样品图。图11是通过实时PCR检测CD4+T细胞的JAK/STAT信号通路阵列，并对其相对表达进行分析图。下面通过附图和具体实施例对本专利技术得到的文冠果种壳提取物在制备防治多发性硬化疾病的药物中的应用进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种文冠果种壳提取物的制备方法，其特征在于，将文冠果种壳先进行甲醇水溶液萃取提取，再加入盐酸进行酸化并过滤，最后用乙酸乙酯萃取，减压下蒸发得到文冠果种壳提取物，硅烷化衍生后，经GC‑MS测定组成及含量，该文冠果种壳提取物中有20种酚类化合物，占文冠果种壳提取物的84.62％，主要酚类化合物为咖啡酸，占20.05％，对羟基苯乙酸，占9.32％，对香豆酸，占8.84％，和邻羟基肉桂酸，占8.29％。

【技术特征摘要】
1.一种文冠果种壳提取物的制备方法，其特征在于，将文冠果种壳先进行甲醇水溶液萃取提取，再加入盐酸进行酸化并过滤，最后用乙酸乙酯萃取，减压下蒸发得到文冠果种壳提取物，硅烷化衍生后，经GC-MS测定组成及含量，该文冠果种壳提取物中有20种酚类化合物，占文冠果种壳提取物的84.62％，主要酚类化合物为咖啡酸，占20.05％，对羟基苯乙酸，占9.32％，对香豆酸，占8.84％，和邻羟基肉桂酸，占8.29％。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，依次按如下步骤制备：(1)取文冠果种壳，粉碎，干燥，得到粉末；(2)取所述粉末，石油醚脱脂，用体积百分比为70％的甲醇水溶液进行提取，得到提取液，所述的甲醇水溶液内每升含有1.0g的BHT；(3)取所述提取液，加入6M的HCl并搅拌，得到混合物；(4)用磁力搅拌器将混合物在35℃加热16小时，待溶液冷却，然后过滤；(5)用乙酸乙酯萃取混合物，得到乙酸乙酯提取物；(6)取乙酸乙酯提取物，并在旋转蒸发器上在35℃减压下蒸发至干，取所述有机相，得到文冠果种壳提取物，溶解于吡啶溶液后，用TMCS和BSTFA在80℃加热45分钟进行硅烷化衍生，再经GC-MS测定衍生物的组成及含量，该文冠果种壳提取物中有20种酚类化合物，占文冠果种壳提取物的84.62％，主要酚类化合物为咖啡酸，占20.05％，对羟基苯乙酸，占9.32％，对香豆酸，占8.84％和邻羟基肉...

【专利技术属性】
技术研发人员：张媛，冶泽青，李星，赵莉，韩娟娟，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61