本发明专利技术涉及一种快速检测阿尔茨海默标志蛋白Tau的自组装免疫阻抗传感器。本发明专利技术通过在金电极表面结合双官能团分子DTSSP(3,3'‑二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯))，并在其基础上修饰一抗，构建了自组装免疫阻抗传感器，成功使用该传感器捕获Tau蛋白，并在此基础上通过结合二抗放大信号。与检测Tau蛋白的传统方法——ELISA，Western Blot相比，该自组装免疫阻抗传感器构建方法简单、操作简便、检测时间短、使用方便。
Self assembled immunosandwich impedance sensor for rapid detection of Alzheimer's marker protein Tau
The present invention relates to a self assembling immune impedance sensor for rapid detection of Alzheimer's marker protein Tau. By combining the DTSSP (3,3'two thiosuccinyl succinyl amyl propionate) on the surface of the gold electrode and modifying the first antibody on the basis of it, the self assembled immune impedance sensor was constructed, and the sensor was successfully used to capture the Tau protein, and on this basis, a two anti amplification signal was combined by combining with the sensor. Compared with the traditional method of detecting Tau protein, ELISA, Western Blot, the self-assembled immune impedance sensor is simple, simple in operation, short in detection time and convenient in use.
【技术实现步骤摘要】
快速检测阿尔茨海默标志蛋白Tau的自组装免疫夹心阻抗传感器
本专利技术涉及一种自组装免疫夹心传感器的制备方法，尤其涉及一种检测阿尔茨海默标志蛋白——Tau的自组装免疫夹心阻抗传感器及其应用。
技术介绍
20世纪以来，人们对生命的期望急剧上升，在人均寿命逐渐升高的情况下，由阿尔茨海默症引起的老年痴呆约占痴呆老人总数的80％，影响全世界6％的老年人口。病理学已经解释AD的标志蛋白之一为Tau蛋白，而目前对Tau蛋白的检测通常为ELISA与WesternBlot，这两种方法具有检测精度低、检测用时长、仪器昂贵等缺点，近年来，随着电化学传感器的发展，关于蛋白质的电化学研究已渐渐深入。其中，电化学交流阻抗谱(EIS)是分析系统复杂电阻的有效方法，该方法对表面现象和整体性质的变化敏感，且检测不影响蛋白构象，非常适合对微量蛋白质的检测。快速检测阿尔茨海默标志蛋白——Tau的自组装免疫夹心阻抗传感器，无需经典的免疫分析方法如放射性同位素标记法及酶联耦合方法中的标记和分离步骤，可以简化分析操作程序，提高分析速度，因此具有响应快、特异性好、小型简便等特点，在致病菌检测的实际应用中潜力巨大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速检测阿尔茨海默标志蛋白——Tau的自组装免疫夹心阻抗传感器的制备方法，该自组装免疫夹心阻抗传感器能够用于Tau蛋白的快速检测。本专利技术通过在金电极表面结合双官能团分子DTSSP(3,3'-二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯))，并在其基础上修饰一抗，构建了自组装免疫阻抗传感器，成功使用该传感器捕获Tau蛋白，并在此基础上通过结合二抗放大信号。研究表明：该自组装免疫夹心阻抗传感器在10分钟内能够直接检测到0.0002μg/mL人Tau蛋白。与传统技术相比，其检测方法更简单、所需样本体积更小、灵敏度更高、检测时间更短、仪器更廉价。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：上述快速检测阿尔茨海默标志蛋白——Tau的自组装免疫夹心阻抗传感器，选择特定的双官能团分子形成自组装膜，针对Tau蛋白使用免疫夹心方法构建，并通过电化学交流阻抗谱(EIS)进行表征。其中特定的双官能团分子为3,3'-二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯)(3,3'-Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate)DTSSP)。通过以下制备方法获取得到，具体包括以下五步：1)对金电极进行打磨并使用超纯水清洗，并进行EIS表征；2)清洗后的金电极在浓度为1-2mg/mL的DTSSP溶液中过夜，并进行EIS表征；3)水洗后在电极表面注射少量一抗溶液，孵育30-60分钟并进行EIS表征；4)pH＝7.0-7.5的PBS浸没洗涤后在电极表面注射与一抗等体积的Tau蛋白，孵育30-60分钟并进行EIS表征；5)pH＝7.0-7.5的PBS浸没洗涤后在电极表面注射与一抗等体积的二抗，孵育30-60分钟并进行EIS表征；本专利技术的另一个目的是这样实现的：快速检测阿尔茨海默标志蛋白——Tau的自组装免疫阻抗传感器应用于Tau的检测，采用EIS对传感器的制作和检测过程进行表征。EIS图像证明了自组装分子层在传感器表面修饰成功，并能够捕获目标。Tau蛋白浓度在0.0002μg/mL-2μg/mL范围内，浓度对数与其阻抗具有线性关系，相关系数为0.9779，线性方程式为y＝8.7301x+33.16。根据Abcam提供的说明书进行单位换算，人Tau蛋白浓度为0.0002μg/mL时，相当于4.3pM，因此，该适体传感器可以直接检测到1pM级的Tau蛋白，表现出一定的优越性。本专利技术的有益效果是：本专利技术制备的快速检测阿尔茨海默标志蛋白——Tau的自组装免疫夹心阻抗传感器的自组装技术，方法简单、操作简便。该自组装免疫夹心阻抗传感器极好的避免了Tau蛋白常规检测方法如ELISA，WesternBlot的缺点，这是由于常规方法要求体积庞大且功率密集的光源、检测器和单色器，以及无法避免由复杂彩色样品产生的潜在错误信号，所需样本体积庞大，且只能定性或者半定量的检测Tau蛋白。如Kosehasanogullari,G等通过ELISA对永久性神经系统障碍患者的脑脊液进行检测，证实患者由于脑萎缩，spm神经影像中显示少数的神经元产生Tau蛋白，同时Tau蛋白水平低的患者更可能产生轴突变性。王琼等通过蛋白质印迹法检测47例胃癌细胞株中Tau蛋白的表达水平，证实Tau蛋白在胃癌细胞中有较高表达，Tau蛋白表达越低的胃癌细胞中紫杉醇的抑制效果越好，敏感性更高。本专利技术制备的快速检测阿尔茨海默标志蛋白——Tau的自组装免疫夹心阻抗传感器用于人Tau蛋白的检测方法简便易行、所需样品量低、响应时间短且检测成本低，实现了对人Tau蛋白的快速检测。该免疫夹心阻抗传感器可以直接检测到1pM级的人Tau蛋白，较ELISA方法对该蛋白的检测高出一个数量级，表现出一定的优越性。本专利技术加快了该免疫传感器商业化的步伐；在未来应用中，能够检测早期阿尔茨海默患者脑脊液中的Tau蛋白，以辅助阿尔茨海默症的早期诊断，从而降低由此造成的社会生产力和经济损失。附图说明图1本专利技术自组装免疫阻抗传感器构建过程原理图；图2本专利技术自组装免疫阻抗传感器制作过程示意图；图3本专利技术自组装免疫阻抗传感器制作过程EIS表征；图4本专利技术自组装免疫阻抗传感器制作过程CV表征；图5本专利技术对EIS阻抗谱图的拟合电路；图6本专利技术基于电路对检测不同浓度Tau蛋白获得的Nyquist信号拟合的折线图；图7本专利技术传感器的性能及表征柱形图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的分析。本专利技术快速检测阿尔茨海默标志蛋白——Tau的自组装免疫阻抗传感器的制备及用于人Tau的检测方法过程所示，具体操作过程如下：下面实施例方法的原理流程图如图1所示。实施例1：1、金电极的清洗Pirannha溶液(30％v/vH2O2：浓H2SO4)处理金表面3min；超纯水冲洗；0.3mm，0.05mm铝粉划“8”字打磨；超纯水冲洗，并进行EIS表征；2、快速检测阿尔茨海默标志蛋白——Tau的自组装免疫阻抗传感器制备检测方法包括以下四步，如图2所示：1)清洗后的金电极在1mg/mL的DTSSP溶液中过夜，并进行EIS表征；2)水洗后注射10μL浓度为0.05mg/mL抗体mab1(本专利技术选用抗体39E10)，反应30分钟，并进行EIS表征；3)pH＝7.2的PBS浸没洗涤后注射10μL浓度为2μg/mLTau蛋白，反应30分钟，并进行EIS表征；4)pH＝7.2的PBS浸没洗涤后注射10μL浓度为0.1mg/mL抗体mab2(本专利技术选用抗体Tau-12)，反应30分钟，并进行EIS表征。3、快速检测阿尔茨海默标志蛋白——Tau的自组装免疫阻抗传感器检测结果计算如下：1)记录传感器构建的每步EIS图，如图3所示，取加入mab2后的阻抗与加入mab1前的阻抗差值作为本专利技术传感器的目标信号；2)通过图5所示电路对目标信号进行拟合，针对拟合结果寻找相应的数学模型来匹配本专利技术的传感器对Tau蛋白的检测结果，其线性关系如图6所示。图4本专利技术自组装免疫阻抗传感器制作过程CV表征。实施例2：1、金电极的清洗Pirannha溶液(30％v/vH2O2：浓H2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.快速检测阿尔茨海默标志蛋白Tau的自组装免疫夹心阻抗传感器，其特征在于：该传感器选择特定的双官能团分子形成自组装膜，针对Tau蛋白使用免疫夹心方法构建，并通过电化学交流阻抗谱(EIS)进行表征。
【技术特征摘要】
1.快速检测阿尔茨海默标志蛋白Tau的自组装免疫夹心阻抗传感器，其特征在于：该传感器选择特定的双官能团分子形成自组装膜，针对Tau蛋白使用免疫夹心方法构建，并通过电化学交流阻抗谱(EIS)进行表征。2.如权利要求1所述的快速检测阿尔茨海默标志蛋白Tau的自组装免疫夹心阻抗传感器，其特征在于上述特定的双官能团分子为DTSSP3,3'-二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯)。3.如权利要求1所述的快速检测阿尔茨海默标志蛋白Tau的自组装免疫夹心阻抗传感器，其特征在于具体采用以下制备方法获取，包括以下步骤：1)对金电极进行...
【专利技术属性】
技术研发人员：李杜娟，樊凯，陈怡宏，刘红英，
申请(专利权)人：杭州电子科技大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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