一种基于蛋白片段互补技术的PGI检测试剂盒、制备及使用方法技术

本发明专利技术提供了一种基于蛋白片段互补技术的PGI诊断试剂盒。所述试剂盒包括：抗PGI抗体偶联的酶蛋白N端片段、抗PGI抗体偶联的酶蛋白C端片段和酶的反应底物；本发明专利技术还公开了所述一种基于蛋白片段互补技术的PGI诊断试剂盒的制备方法，该方法包括：抗PGI抗体偶联的酶蛋白N端片段的制备、抗PGI抗体偶联的酶蛋白C端片段的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本发明专利技术试剂盒具有操作简单、特异性好、免清洗、精确度高等优点，便于临床检测使用，可预警胃癌发生，对预防胃癌具有相当重要的意义，具有极大的市场价值。

PGI detection kit based on protein fragment complementation technology, preparation and application method

The invention provides a PGI diagnostic kit based on protein fragment complementation technology. The kit includes the N end fragment of anti PGI antibody coupling enzyme protein, the C end fragment of the enzyme protein coupled with anti PGI antibody and the reaction substrate of the enzyme, and the present invention also discloses a preparation method of the PGI diagnostic kit based on the complementary technique of protein fragment, which includes the preparation of the N end fragment of the enzyme protein conjugated to the anti PGI antibody. The preparation of the C end fragment of the enzyme protein which is prepared and anti PGI antibody is prepared, and the method of using the kit is also disclosed. The kit has the advantages of simple operation, good specificity, free cleaning and high accuracy, easy to use in clinical detection, early warning of the occurrence of gastric cancer, and is of considerable significance to pre control of gastric cancer. Great market value.

【技术实现步骤摘要】
一种基于蛋白片段互补技术的PGI检测试剂盒、制备及使用方法
本专利技术涉及一种蛋白片段互补技术用于体外免疫诊断检测人体内PGI的含量，属于疾病诊断检测领域。
技术介绍
胃癌是全球的第四大常见癌症，是第二大癌症死因，仅次于肺癌。中国的胃癌发病率已超过日本，并且呈上升趋势。胃癌若能早期诊断，5年生存率一般超过90％，若诊断时已是晚期，5年生存率可能仅为10％-20％。一项回顾性研究证明90％以上的胃癌患者合并有萎缩性胃炎。普遍认为萎缩性胃炎是很重要的癌前病变，在癌症的发病机制中起着至关重要的作用。胃蛋白酶原是胃液中胃蛋白酶没有消化活性的前体物质，分为胃蛋白酶原I(PGI)和胃蛋白酶原II(PGII)两类，大部分的胃蛋白酶原进入胃腔，只有极少量(约1％)透过毛细血管进入血液，血清中的浓度反映了其分泌水平。其中PGI主要由胃腺的主细胞和黏液颈细胞分泌，PGI是检测胃泌酸腺细胞功能的指针，胃酸分泌增多PGI升高，分泌减少或胃粘膜腺体萎缩PGI降低。萎缩性胃炎是胃癌的主要癌前病变，当发生萎缩性胃炎时，腺体和主细胞数量减少，引起胃蛋白酶原I分泌下降。由于在浅表性胃炎-胃粘膜糜烂溃疡-萎缩性胃炎-胃癌的发展过程中，均伴随着胃蛋白酶原的变化，胃蛋白酶原不仅成为这三种病变的良好诊断析指标，而且是治疗和预防干预过程中最要的监测指标。PGI检测试剂盒用于检测血清或者血浆中的胃蛋白酶原I的含量，具有简便、快速的优势，避免了X-射线对人体的侵害和胃镜的不便。常规的PGI的测定主要采用的是免疫抑制法以及酶联免疫吸附法，免疫抑制法检测迅速、省时，有较高的敏感性，但是影响因素和缺陷众多。酶联免疫吸附法具有操作简单，试剂稳定期长的特点，但检测灵敏度较低。为解决上述问题，利用蛋白片段互补技术，以PGI的抗体构建技术平台，研发出一种简便、直观、灵敏的PGI快速检测试剂。将其应用于检测胃泌酸腺细胞功能的检测，可提高萎缩性胃炎诊断的准确率，具有极大的市场价值。
技术实现思路
针对现有技术中存在的技术问题，本专利技术提供一种可用于定量检测PGI的检测试剂盒、其制备及使用方法。本专利技术通过以下技术方案实现：一种制备基于蛋白片段互补技术PGI检测试剂盒的方法，包括如下步骤：1)抗PGI抗体偶联酶蛋白N端片段；2)抗PGI抗体偶联酶蛋白C端片段；在上述技术方案中，所述抗PGI抗体为针对PGI不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。在上述方案中，所述抗PGI抗体偶联酶蛋白N端片段的步骤中，酶蛋白N端片段与抗PGI抗体的质量比为1∶1-10。在上述方案中，所述抗PGI抗体偶联酶蛋白C端片段的步骤中，酶蛋白C端片段与抗PGI抗体的质量比为1∶1-10。根据以上任一技术方案所述所制备的基于蛋白片段互补技术的PGI检测试剂盒。其主要组成包括：1)抗PGI抗体偶联的酶蛋白N端片段；2)抗PGI抗体偶联的酶蛋白C端片段。以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗PGI抗体偶联的酶蛋白N端片段和抗PGI抗体偶联的酶蛋白C端片段，混合反应5-10min，加入酶底物反应1-5min；2)测量每个反应孔的吸光值。此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。附图说明图1是本专利技术实施例提供的基于蛋白片段互补技术的PGI检测试剂盒原理示意图，其中，1-抗PGI抗体，2-连接剂，3-酶蛋白N端片段，4-待测物(PGI)，5-抗PGI抗体，6-酶蛋白C端片段，7-连接剂。图2是本专利技术实施例提供的基于蛋白片段互补技术的PGI检测试剂盒检测线性范围图。图3是本专利技术实施例提供的基于蛋白片段互补技术的PGI检测试剂盒结果相关性比较。具体实施方式以下参考附图对本专利技术的基于蛋白片段互补技术的PGI检测试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。实施例1抗PGI抗体偶联酶蛋白N端片段，以β-内酰胺酶(β-lactamase)的26-196氨基酸的片段β-lactamaseN为例，具体实施过程为：1)将0.1mgβ-lactamaseN蛋白加入到离心管中，用0.05mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将β-lactamaseN蛋白稀释到1mg/mL。2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。3)37℃水浴反应2h。4)用脱盐柱SephadexG-25或0.05mol/LpH9.5CB透析除去过量戊二醛。5)取0.1mg抗PGI抗体，用0.05mol/LpH9.5CB配制1mg/mL抗体，将活化的β-lactamaseN蛋白和抗体混合。6)4℃，反应过夜。7)封闭：加入50μL0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。8)4℃放置2h。9)将反应物通过SephadexG-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/LpH7.2PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。实施例2抗PGI抗体偶联酶蛋白C端片段，以β-内酰胺酶(β-lactamase)的198-290氨基酸的片段β-lactamaseC为例，具体实施过程为：1)将0.1mgβ-lactamaseC蛋白加入到离心管中，用0.05mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将β-lactamaseC蛋白稀释到1mg/mL。2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。3)37℃水浴反应2h。4)用脱盐柱SephadexG-25或0.05mol/LpH9.5CB透析除去过量戊二醛。5)取0.1mg抗PGI抗体，用0.05mol/LpH9.5CB配制1mg/mL抗体，将活化的β-lactamaseC蛋白和抗体混合。6)4℃，反应过夜。7)封闭：加入50μL0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。8)4℃放置2h。9)将反应物通过SephadexG-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/LpH7.2PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。实施例3试剂盒主要组成：1)抗PGI抗体偶联的酶蛋白N端片段；2)抗PGI抗体偶联的酶蛋白C端片段。实施例4试剂盒使用方法，包括如下步骤：1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗PGI抗体偶联的酶蛋白N端片段、抗PGI抗体偶联的酶蛋白C端片段，混合反应5-10min，加入酶底物反应1-5min；2)测量每个反应孔吸光值。此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。实施例5本专利技术试剂盒方法学评价：1.线性配制浓度为0ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL的PGI标准品溶液。在反应孔中分别加入10μL标准品、加入50μL抗PGI抗体偶联的酶蛋白N端片段，加入50μL抗PGI抗体偶联的酶蛋白C端片段，37℃温育5min。加入酶显色底物头孢硝噻吩反应1-5min后，492nm下测量每个反应孔吸光值。以吸光值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线(见附图2)。2.准确度回收率试验：用已知量PGI标准品加入到正常人的血清标本中，测量加入后浓度值与加入的理论值进行比较，计算PGI的回收率。检测结果如下：样本编号加入PGI浓度(ng/mL)测量PGI的浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于蛋白片段互补技术的PGI检测试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：1)试剂盒主要组成：抗PGI抗体偶联的酶蛋白N端片段，抗PGI抗体偶联的酶蛋白C端片段和酶的反应底物；2)使用方法：在试剂盒的反应孔中加入样本、抗PGI抗体偶联的酶蛋白N端片段和PGI体抗体偶联的酶蛋白C端片段，混合反应5‑10min，加入酶底物反应1‑5min；3)检测方法：测量每个反应孔的吸光值。

【技术特征摘要】
1.一种基于蛋白片段互补技术的PGI检测试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：1)试剂盒主要组成：抗PGI抗体偶联的酶蛋白N端片段，抗PGI抗体偶联的酶蛋白C端片段和酶的反应底物；2)使用方法：在试剂盒的反应孔中加入样本、抗PGI抗体偶联的酶蛋白N端片段和PGI体抗体偶联的酶蛋白C端片段，混合反应5-10min，加入酶底物反应1-5min；3)检测方法：测量每个反应孔的吸光值。2.一种基于蛋白片段互补技术的PGI检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)抗PGI抗体偶联酶蛋白N端片段的制备；2)抗PGI抗体偶联酶蛋白C端片段的制备。3.根据权利要求1所述的抗PGI抗体为针对PGI不同表位的单克隆抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐林，
申请(专利权)人：南京天纵易康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32