一种抗体偶联羧化磁珠的方法技术

本发明专利技术公开了一种抗体偶联羧化磁珠的方法，属于免疫检测学技术领域。该方法的主要步骤包括：洗涤羧化磁珠、加入EDC无水乙醇溶液活化羧化磁珠、加入抗体包被羧化磁珠、封闭和存储。本发明专利技术通过在有机相中进行羧化磁珠的活化，并对EDC无水乙醇溶液进行热处理，克服了在水相中应用EDC水溶液活化羧化磁珠而产生的EDC不稳定的现象，提高抗体偶联羧化磁珠过程的可操作性和可重复性，并可增强抗原抗体反应的反应性，操作简单，效果明显，为羧化磁珠在诊断试剂中的应用提供了新的思路，具有广阔的市场价值和应用前景。

An antibody coupling method for carboxylation of magnetic beads

The invention discloses a method for coupling antibodies to carboxyl magnetic beads, belonging to the technical field of immunoassay. The main steps of the method include: scrubbing carboxylated magnetic beads, activating carboxylation beads in EDC anhydrous ethanol solution, adding antibodies to carboxylation beads, sealing and storing. By activating the carboxylated magnetic beads in the organic phase and heat treating the EDC anhydrous ethanol solution, the invention overcomes the EDC instability caused by the activation of the carboxylated magnetic beads in the aqueous phase of the EDC aqueous solution, and improves the operability and repeatability of the antibody coupling carboxylated magnetic beads and the enhancement of the antigen antibody reaction. The reactivity is simple and the effect is obvious. It provides a new idea for the application of carboxyl magnetic beads in the diagnostic reagents, and has a broad market value and application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种抗体偶联羧化磁珠的方法
本专利技术涉及免疫检测学
，具体涉及一种抗体偶联羧化磁珠的方法。
技术介绍
随着抗原抗体免疫检测分析技术的突飞猛进，应用磁微粒作为抗原或抗体的载体来检测待测物已经成为生物领域主要的检测手段，其中表面修饰有羧基的羧化磁珠是常用的几种磁珠的类型之一。在现有的技术方案中，主要应用乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)的水溶液与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)联用来实现羧化磁珠与抗原或抗体的偶联，单独使用EDC水溶液也可实现羧化磁珠与抗原或抗体的偶联，只是偶联效率稍低。专利CN104483477A公开了一种偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法，其中磁珠包被方法的步骤为：以MESbuffer作为活化缓冲液，对表面有羧基的磁珠进行活化；以BSTbuffer作为缓冲液，将活化后的磁珠与单克隆抗体16A11/810进行偶联。但由于其应用的活化缓冲液为水溶液，EDC遇水不稳定，会大大降低其偶联效率，除了在保存和使用过程中应完全避免接触空气中的水分外，在配制水溶液的操作过程中要求也较高，不仅需要现用现配，而且不同配制批次之间的使用效率并不能够得到保证。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种抗体偶联羧化磁珠的方法，该方法能够实现在应用EDC活化羧化磁珠的过程中避免羧化磁珠与抗体的偶联不受水分子的干扰，大大提高了羧化磁珠与抗体的偶联效率，操作简便高效，易于推广，具有较佳的市场前景。为解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种抗体偶联羧化磁珠的方法，其包括以下步骤：1)使用有机溶剂对羧化磁珠进行洗涤，然后再用无水乙醇洗涤羧化磁珠；2)弃上清，加入经过热处理的EDC无水乙醇溶液，振荡混匀；3)用包被缓冲液洗涤羧化磁珠，弃上清，加入包被缓冲液和抗体进行偶联，振荡混匀。作为本专利技术优选的实施方式，所述步骤1)中的有机溶剂为DMF(二甲基甲酰胺)或DMSO(二甲基亚砜)。作为本专利技术优选的实施方式，所述步骤1)和步骤2)的无水乙醇也可以是甲醇、丙醇、正丁醇、异丁醇中的一种。作为本专利技术优选的实施方式，所述步骤2)中的EDC无水乙醇溶液的浓度为2.5～100mg/ml，优选为50mg/ml。作为本专利技术优选的实施方式，所述步骤2)中热处理的条件为：将EDC无水乙醇溶液置于恒温箱中在25～65℃的温度下热处理0～24h。进一步优选地，所述热处理温度优选为55℃，热处理时间优选为4h。作为本专利技术优选的实施方式，所述步骤3)中偶联时包被缓冲液体积与羧化磁珠的加入比例为2～18:1，优选为2:1。作为本专利技术优选的实施方式，所述步骤2)和步骤3)中的振荡混匀过程如下：置于恒温振荡仪中在22～28℃下以800～1000rpm转速振荡0.5～3h。作为本专利技术优选的实施方式，本专利技术的方法还包括步骤4)：向偶联抗体后的羧化磁珠中加入磁珠封闭液和赖氨酸，置于摇床上35～38℃下旋转1～3h。作为本专利技术优选的实施方式，本专利技术的方法还包括步骤5)：向经过封闭的羧化磁珠加入磁珠工作液重悬，使羧化磁珠的浓度为80～150mg/ml，置于2～8℃下存储。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术所述的抗体偶联羧化磁珠的方法通过将EDC溶解于无水乙醇溶液中，并对EDC无水乙醇溶液进行热处理，在有机相中进行羧化磁珠的活化，克服了在水相中应用EDC水溶液活化羧化磁珠易受到水分子干扰而产生的EDC不稳定的现象，提高抗体偶联羧化磁珠过程的可操作性和可重复性，提高羧化磁珠与抗体的偶联效率，并可增强抗原抗体反应的反应性，操作简单，效果明显，为羧化磁珠在诊断试剂中的应用提供了新的思路。本专利技术所提供的方法工艺步骤简单，操作简便，易于推广，具有广阔的市场价值和应用前景。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本专利技术，而非对本专利技术的限定。一种抗体偶联羧化磁珠的方法，其包括以下步骤：1)使用有机溶剂对羧化磁珠进行洗涤，然后再用无水乙醇洗涤羧化磁珠；2)弃上清，加入经过热处理的浓度为2.5～100mg/ml的EDC无水乙醇溶液，置于恒温振荡仪中在22～28℃下以800～1000rpm转速振荡30～60min，使其混匀；其中，热处理的条件为：将EDC无水乙醇溶液置于恒温箱中在25～65℃的温度下热处理0～24h；3)用包被缓冲液洗涤羧化磁珠，弃上清，加入包被缓冲液和抗体进行偶联，置于恒温振荡仪中在22～28℃下以800～1000rpm转速振荡1～5h，使其混匀；偶联时包被缓冲液体积(μl)与羧化磁珠(30μg/人份)的加入比例为2～18:1；4)向偶联抗体后的羧化磁珠中加入磁珠封闭液和赖氨酸，置于摇床上35～38℃下旋转1～3h；5)向经过封闭的羧化磁珠加入磁珠工作液重悬，使羧化磁珠的浓度为80～150mg/ml，置于2～8℃下存储。上述方法中，有机溶剂优选为DMF或DMSO；无水乙醇也可以是甲醇、丙醇、正丁醇、异丁醇中的一种。专利技术人在现有技术的基础上，通过大量实验，发现了将EDC溶解于有机相中，并对其溶液进行热处理后，用于活化羧化磁珠，再进行偶联抗体的方法，能够使得羧化磁珠偶联抗体的效率不受水分子的干扰，提高EDC活化羧化磁珠的效率，从而提高抗体与羧化磁珠的偶联效率，并通过大量实验，优化了抗体偶联磁珠过程中的相关条件，为无论是单独使用EDC活化羧化磁珠还是联合使用EDC与NHS活化羧化磁珠，再进行抗体与羧化磁珠的偶联，都提供了全新的思路。实施例1：1)先配制包被缓冲液、磁珠洗涤液、磁珠封闭液和磁珠工作液，备用；2)用有机溶剂DMF洗涤3mg羧化磁珠一次，再用无水乙醇洗涤羧化磁珠两次；3)用无水乙醇溶解EDC，使得EDC无水乙醇溶液的浓度为50mg/ml，并将EDC无水乙醇溶液放置于55℃恒温孵箱中进行热处理4h；4)向弃去上清的羧化磁珠中加入200μl偶联剂EDC无水乙醇溶液，充分混匀；置于恒温振荡仪上在25℃下以1000rpm的转速振荡40min；5)用1.8ml包被缓冲液洗涤羧化磁珠两次；6)向上述洗涤后弃去上清的羧化磁珠中加入200μl包被缓冲液，再加入所需包被量的AFP抗体，充分混匀，包被缓冲液体积(μl)与磁珠人份数(30μg/人份，100人份)的加入比例为2:1；置于恒温振荡仪上在25℃下以1000rpm的转速振荡3h；7)用1.8ml包被缓冲液洗涤羧化磁珠两次；8)向上述洗涤后弃去上清的羧化磁珠中加入1.8ml磁珠封闭液和10mM赖氨酸，置于摇床上在37℃下旋转1.5h；9)将羧化磁珠重悬在磁珠工作液中，配制成120mg/ml的工作浓度，存储在2～8℃的环境中。实施例2：与实施例1相比，除了EDC无水乙醇溶液的浓度为2.5mg/ml外，本实施例的其他条件与实施例1相同。实施例3：与实施例1相比，除了EDC无水乙醇溶液的浓度为100mg/ml外，本实施例的其他条件与实施例1相同。实施例4：与实施例1相比，除了包被缓冲液体积(μl)与磁珠人份数(30μg/人份)的加入比例为18:1外，本实施例的其他条件与实施例1相同。实施例5：与实施例1相比，除了包被缓冲液体积(μl)与磁珠人份数(30μg/人份)的加入比例为6:1外，本实施例的其他条件与实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗体偶联羧化磁珠的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)使用有机溶剂对羧化磁珠进行洗涤，然后再用无水乙醇洗涤羧化磁珠；2)弃上清，加入经过热处理的EDC无水乙醇溶液，振荡混匀；3)用包被缓冲液洗涤羧化磁珠，弃上清，加入包被缓冲液和抗体进行偶联，振荡混匀。

【技术特征摘要】
1.一种抗体偶联羧化磁珠的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)使用有机溶剂对羧化磁珠进行洗涤，然后再用无水乙醇洗涤羧化磁珠；2)弃上清，加入经过热处理的EDC无水乙醇溶液，振荡混匀；3)用包被缓冲液洗涤羧化磁珠，弃上清，加入包被缓冲液和抗体进行偶联，振荡混匀。2.根据权利要求1所述的抗体偶联羧化磁珠的方法，其特征在于：所述步骤1)中的有机溶剂为DMF或DMSO。3.根据权利要求1所述的抗体偶联羧化磁珠的方法，其特征在于：所述步骤1)和步骤2)的无水乙醇也可以是甲醇、丙醇、正丁醇、异丁醇中的一种。4.根据权利要求1所述的抗体偶联羧化磁珠的方法，其特征在于：所述步骤2)中的EDC无水乙醇溶液的浓度为2.5～100mg/ml，优选为50mg/ml。5.根据权利要求1所述的抗体偶联羧化磁珠的方法，其特征在于：所述步骤2)中热处理的条件为：将EDC无水乙醇溶液置于恒温箱中在25～65℃的温度下...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓红，曾敏霞，林燕清，
申请(专利权)人：珠海丽珠试剂股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44