一种深度序列质谱分析方法技术

本发明专利技术公开了一种深度序列质谱分析方法，包括以下步骤：(1)细胞培养；(2)为DEEP SEQ分析准备样品；(3)DEEP SEQ多维分离。本发明专利技术直接基于去垢剂的蛋白质溶解、单酶胰酶酶切和扩增，肽段通过多重物理化学正交阶段：高PH反相和强阴离子交换串联耦合，并直接借助于装准的纳升级流速体系，在细孔、延伸长度(25μm×100cm)的低PH RP分析柱上运行，以实现全自动化实时分离。后者的色谱分析阶段在第三个正交维度下获得高峰容，并增加了电离喷雾离子化效率，从而提高检测水平。

A method of deep sequence mass spectrometry

The present invention discloses a deep sequence mass spectrometry analysis method, including the following steps: (1) cell culture; (2) preparing samples for DEEP SEQ analysis; (3) multidimensional separation of DEEP SEQ. The present invention is directly based on the protein dissolving and single enzyme pancreatin digestion and amplification of the detergent. The peptide segment is coupled in series through multiple physical and chemical orthogonal stages: high PH reverse phase and strong anion exchange, and is directly operated on a low PH RP analysis column with a fine hole and an extended length (25 mu m x 100cm). The realization of full automation in real time separation. In the latter chromatographic analysis stage, the peak volume was obtained under third orthogonal dimensions, and the ionization spray ionization efficiency was increased, thus improving the detection level.

【技术实现步骤摘要】
一种深度序列质谱分析方法
本专利技术涉及一种分析方法，具体是一种深度序列质谱分析方法。
技术介绍
自从最初提出人类基因组粗测序以来，DNA和RNA测序便快速发展。尽管特定的因果基因元件鉴定被认为是一项重要挑战，但基因型-表现型关联研究不断阐明了人类疾病环境下大基因组区域仍被扩充、删除或反向改变。尽管存在多种成功案例，但最主要的DNA序列数据并未捕获蛋白质翻译、降解和翻译后修饰等状态的下游调控信息。这些数据是研究定量监视生物反应微扰或构建细胞生理学预测模型的重要成分。因此，一个清晰和尚需完善的方法论可以为蛋白质提供系统而定量的序列特性描述，从而成为DNA和RNA数据的重要功能补充。蛋白表达的宽动态范围和大量的翻译后修饰，加上分析物缺乏类似于PCR的扩增策略，描述全基因组的蛋白质具有巨大挑战，尤其对于一些常以低丰度出现的信号转导和其他关键调控因子更是如此。因此，大量的鸟枪法测序方法频繁依赖于对亚细胞隔室或完整蛋白质的低通量预前分离(例如，优先LC-MS/MS分析)来提高动态范围。然而这些技术受制于持续性地提高，它们还尚未取得基因组规模下的蛋白质鉴定和定量，而且，在多数情况下，预分离技术的劳动密集特征阻碍了其被广泛采纳和标准化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种深度序列质谱分析方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种深度序列质谱分析方法，包括以下步骤：(1)细胞培养；酵母细胞品种S288C，在酵母提取蛋白胨葡萄糖液相中生长至对数期；细胞加入SDS细胞裂解液，煮沸裂解并离心，将上清液储存在-80℃冰箱；首先，室温下，将10cm的Nunclon组织培养皿表面覆上0.1％明胶30min，老鼠胚胎干细胞J1mESC布板在密度为6×104/cm2的Dulbecco修改后的伊戈尔培养基上，提供高糖环境并增补L-谷氨酸、15％胚胎干细胞验证的胎牛血清、2-巯基乙醇、核苷、非必须氨基酸和10ng/mL鼠类LIF6；扰动实验按以上条件构建，J1mESC去除LIF648h；收获细胞时，培养基用冷的PBS冲洗掉血清蛋白，添加煮沸的SDS来溶解粘连细胞；溶解的细胞经过离心取出上清存储于-80℃；(2)DEEPSEQ分析的样品制备：通过加入6体积-20℃的丙酮使蛋白质沉淀，并用含8M尿素和0.1MNH4HCO3的消化缓冲液重新溶解，BCA的方法测定总蛋白含量；添加二硫苏糖醇至最终浓度为10mM，60℃下孵育30min；接着添加甲基硫甲磺酸酯至终浓度20mM，室温下避光孵育30min,过量的MMTS用终浓度为20mM的DTT吸收；还原的和烷基化的蛋白质用0.1MNH4HCO3稀释，接着添加胰酶，37℃下立式圆筒式旋转酶切过夜；消化后的样品溶液用SepPakC18反相墨盒除尿素和其他盐类；洗脱的肽段经真空离心快速冻干；肽段采用4-plexiTRAQ试剂标记；两个0.2μg的酵母肽段分别被标记114和115；其他两个1.0μg的酵母肽段分别标记116和117；此外，两个来自mESC的6.3μg肽段标记114和116；对于mESC扰动实验，未加LIF孵育的细胞肽段作为技术重复分别标记为116和117，而加入LIF孵育的细胞肽段作为技术重复标记为114和115；肽段用500mMTEAB重悬，加入适量的iTRAQ试剂在无水乙醇中进行标记反应；室温下标记反应1h，将样品混合并用真空离心机烘干；对新鲜的mESC按以上描述进行处理设计生物学重复；(3)DEEPSEQ多维分离；三维肽段分离在改良过的WatersNanoAcquityUHPLC系统下操作操作，这一系统带有二元和等重泵、自动进样器和附加的6孔，2位阀；一维反相色谱柱由一个200μm内径的毛细管塞满5μm直径的XBridgeC18树脂组成；阴离子交换色谱柱充满5μm直径的SAX树脂，并连接到一维反相色谱柱的排放孔；第三维由反相的前置柱和分析柱以开口型几何结构配置而成；自动进样器以2μL/min的速度乘载和递送肽段样品或一维和二维洗脱液通过进样环路；射入轨道的每个1维或2维洗脱液组成一个“DEEPSEQ部分”；二元泵以8μL/min的速度递送0.1％的甲酸来稀释有机质含量，并在进入三维前置柱前酸化一维或二维流出物，或以5nL/min的流速从三维反相柱中对肽段进行梯度洗脱来进行LC-MS/MS分析；在LC-MS/MS吸收或当注射的肽段样品或1st/2nd维洗脱液因重力驱使使液滴滴下时，一个数字化的PicoView电喷射源平台被用于ObitrapXL和5600三重飞行时间质谱仪，自动将发射尖端定位到源入口或重力驱动的液滴状态之下。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术直接基于去垢剂的蛋白质溶解、单酶胰酶酶切和扩增，肽段通过多重物理化学正交阶段：高PH反相和强阴离子交换串联耦合，并直接借助于装准的纳升级流速体系，在细孔、延伸长度(25μm×100cm)的低PHRP分析柱上运行，以实现全自动化实时分离。后者的色谱分析阶段在第三个正交维度下获得高峰容，并增加了电离喷雾离子化效率，从而提高检测水平。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。实施例1一种深度序列质谱分析方法，包括以下步骤：(1)细胞培养；酵母细胞品种S288C，在酵母提取蛋白胨葡萄糖液相中生长至对数期；细胞加入SDS细胞裂解液，煮沸裂解并离心，将上清液储存在-80℃冰箱；首先，室温下，将10cm的Nunclon组织培养皿表面覆上0.1％明胶30min，老鼠胚胎干细胞J1mESC布板在密度为6×104/cm2的Dulbecco修改后的伊戈尔培养基上，提供高糖环境并增补L-谷氨酸、15％胚胎干细胞验证的胎牛血清、2-巯基乙醇、核苷、非必须氨基酸和10ng/mL鼠类LIF6；扰动实验按以上条件构建，J1mESC去除LIF648h；收获细胞时，培养基用冷的PBS冲洗掉血清蛋白，添加煮沸的SDS来溶解粘连细胞；溶解的细胞经过离心取出上清存储于-80℃；(2)DEEPSEQ分析的样品制备：通过加入6体积-20℃的丙酮使蛋白质沉淀，并用含8M尿素和0.1MNH4HCO3的消化缓冲液重新溶解，BCA的方法测定总蛋白含量；添加二硫苏糖醇(DTT)至最终浓度为10mM，60℃下孵育30min；接着添加甲基硫甲磺酸酯(MMTS)至终浓度20mM，室温下避光孵育30min,过量的MMTS用终浓度为20mM的DTT吸收；还原的和烷基化的蛋白质用0.1MNH4HCO3稀释，接着添加胰酶，37℃下立式圆筒式旋转酶切过夜；消化后的样品溶液用SepPakC18反相墨盒除尿素和其他盐类；洗脱的肽段经真空离心快速冻干；肽段采用4-plexiTRAQ试剂标记；两个0.2μg的酵母肽段分别被标记114和115；其他两个1.0μg的酵母肽段分别标记116和117；此外，两个来自mESC的6.3μg肽段标记114和116；对于mESC扰动实验，未加LIF孵育的细胞肽段作为技术重复分别标记为116和117，而加入LIF孵育的细胞肽段作为技术重复标记为114和115；肽段用500mMTEAB重悬，加入适量的iTRAQ试剂在无水乙醇中进行标记反应；室温下标记反应1h，将样品混合并用真空离心机烘干；对新鲜的m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种深度序列质谱分析方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)细胞培养；酵母细胞品种S288C，在酵母提取蛋白胨葡萄糖液相中生长至对数期；细胞加入SDS细胞裂解液，煮沸裂解并离心，将上清液储存在‑80℃冰箱；首先，室温下，将10cm的Nunclon组织培养皿表面覆上0.1％明胶30min，老鼠胚胎干细胞J1mESC布板在密度为6×104/cm2的Dulbecco修改后的伊戈尔培养基上，提供高糖环境并增补L‑谷氨酸、15％胚胎干细胞验证的胎牛血清、2‑巯基乙醇、核苷、非必须氨基酸和10ng/mL鼠类LIF6；扰动实验按以上条件构建，J1mESC去除LIF6 48h；收获细胞时，培养基用冷的PBS冲洗掉血清蛋白，添加煮沸的SDS来溶解粘连细胞；溶解的细胞经过离心取出上清存储于‑80℃；(2)DEEP SEQ分析的样品制备：通过加入6体积‑20℃的丙酮使蛋白质沉淀，并用含8M尿素和0.1M NH4HCO3的消化缓冲液重新溶解，BCA的方法测定总蛋白含量；添加二硫苏糖醇至最终浓度为10mM，60℃下孵育30min；接着添加甲基硫甲磺酸酯至终浓度20mM，室温下避光孵育30min,过量的MMTS用终浓度为20mM的DTT吸收；还原的和烷基化的蛋白质用0.1M NH4HCO3稀释，接着添加胰酶，37℃下立式圆筒式旋转酶切过夜；消化后的样品溶液用SepPak C18反相墨盒除尿素和其他盐类；洗脱的肽段经真空离心快速冻干；肽段采用4‑plex iTRAQ试剂标记；两个0.2μg的酵母肽段分别被标记114和115；其他两个1.0μg的酵母肽段分别标记116和117；此外，两个来自mESC的6.3μg肽段标记114和116；对于mESC扰动实验，未加LIF孵育的细胞肽段作为技术重复分别标记为116和117，而加入LIF孵育的细胞肽段作为技术重复标记为114和115；肽段用500mM TEAB重悬，加入适量的iTRAQ试剂在无水乙醇中进行标记反应；室温下标记反应1h，将样品混合并用真空离心机烘干；对新鲜的mESC按以上描述进行处理设计生物学重复；(3)DEEP SEQ多维分离；三维肽段分离在改良过的Waters NanoAcquity UHPLC系统下操作操作，这一系统带有二元和等重泵、自动进样器和附加的6孔，2位阀；一维反相色谱柱由一个200μm内径的毛细管塞满5μm直径的XBridge C18树脂组成；阴离子交换色谱柱充满5μm直径的SAX树脂，并连接到一维反相色谱柱的排放孔；第三维由反相的前置柱和分析柱以开口型几何结构配置而成；自动进样器以2μL/min的速度乘载和递送肽段样品或一维和二维洗脱液通过进样环路；射入轨道的每个1维或2维洗脱液组成一个“DEEP SEQ部分”；二元泵以8μL/min的速度递送0.1％的甲酸来稀释有机质含量，并在进入三维前置柱前酸化一维或二维流出物，或以5nL/min的流速从三维反相柱中对肽段进行梯度洗脱来进行LC‑MS/MS分析；在LC‑MS/MS吸收或当注射的肽段样品或1st/2nd维洗脱液因重力驱使使液滴滴下时，一个数字化的Pico View电喷射源平台被用于Obitrap XL和5600三重飞行时间质谱仪，自动将发射尖端定位到源入口或重力驱动的液滴状态之下。...

【技术特征摘要】
1.一种深度序列质谱分析方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)细胞培养；酵母细胞品种S288C，在酵母提取蛋白胨葡萄糖液相中生长至对数期；细胞加入SDS细胞裂解液，煮沸裂解并离心，将上清液储存在-80℃冰箱；首先，室温下，将10cm的Nunclon组织培养皿表面覆上0.1％明胶30min，老鼠胚胎干细胞J1mESC布板在密度为6×104/cm2的Dulbecco修改后的伊戈尔培养基上，提供高糖环境并增补L-谷氨酸、15％胚胎干细胞验证的胎牛血清、2-巯基乙醇、核苷、非必须氨基酸和10ng/mL鼠类LIF6；扰动实验按以上条件构建，J1mESC去除LIF648h；收获细胞时，培养基用冷的PBS冲洗掉血清蛋白，添加煮沸的SDS来溶解粘连细胞；溶解的细胞经过离心取出上清存储于-80℃；(2)DEEPSEQ分析的样品制备：通过加入6体积-20℃的丙酮使蛋白质沉淀，并用含8M尿素和0.1MNH4HCO3的消化缓冲液重新溶解，BCA的方法测定总蛋白含量；添加二硫苏糖醇至最终浓度为10mM，60℃下孵育30min；接着添加甲基硫甲磺酸酯至终浓度20mM，室温下避光孵育30min,过量的MMTS用终浓度为20mM的DTT吸收；还原的和烷基化的蛋白质用0.1MNH4HCO3稀释，接着添加胰酶，37℃下立式圆筒式旋转酶切过夜；消化后的样品溶液用SepPakC18反相墨盒除尿素和其他盐类；洗脱的肽段经真空离心快速冻干；肽段采用4-plexiTRAQ试剂标记；两个0.2μg的酵母肽段分别被标记114和115；其他两个1.0μg的酵母肽段分别标记116...

【专利技术属性】
技术研发人员：戚良，
申请(专利权)人：上海悦良生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31