一种分离黄酮类成分的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种分离结构近似的黄酮类成分的方法，所述方法基于高效液相色谱法，所述结构近似的黄酮类成分至少包括紫云英苷和槲皮苷；色谱条件为：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.05％～0.5％(体积百分比)磷酸水溶液，采用梯度洗脱：0‑40min，7％～25％A，其余为B；40‑60min，25％～50％A，其余为B。该方法第一次实现了紫云英苷和槲皮苷的分离。本发明专利技术还提供上述方法在检测柿叶提取物中黄酮类成分中的应用，尤其是一种基于一测多评法测定柿叶提取物或其制剂中黄酮类成分含量中的应用。

A method for the separation of flavonoids and its application

The present invention relates to a method for separating flavonoids from similar structures. The method is based on high performance liquid chromatography (HPLC). The approximate flavonoids in the structure include at least the glucoside and quercetin; the chromatographic conditions are: the fixed phase: Eighteen alkyl silane bonded silica gel; the mobile phase A is acetonitrile and the mobile phase B is 0 5% to 0.5% (volume percentage) phosphate water solution, gradient elution: 0 40min, 7% ~ 25%A, the rest B, 40 60min, 25% to 50%A, and the rest B. The method achieved the first separation of astragalin and quercetin. The invention also provides the application of the method in the determination of flavonoids in the extract of persimmon leaves, especially the application of a one measurement and multi evaluation method to determine the content of flavonoids in persimmon leaves extract or its preparation.

【技术实现步骤摘要】
一种分离黄酮类成分的方法及其应用
本专利技术属于分析化学领域，具体涉及一种基于高效液相色谱法分离结构近似的黄酮类成分的方法及其应用。
技术介绍
黄酮类化合物是以2-苯基色原酮为母核的一系列化合物，其具有广泛的生理活性，如抗氧化、抗炎、抗过敏、修复受损DNA等等。但是因为其母核结构相对简单，取代基类型比较有限，主要是羟基、甲氧基、糖基等，导致结构相近的黄酮类化合物即使借助高效液相系统也难以分离。例如金丝桃苷(结构式如1所示)、异槲皮苷(结构式如2所示)、槲皮苷(结构式如3所示)、紫云英苷(结构式如4所示)、杨梅素(结构式如5所示)、槲皮素(结构式如6所示)和山柰酚(结构式如7所示)；尤其是紫云英苷和槲皮苷在液相分析时容易造成混淆。本专利技术人在研究中发现，紫云英苷(又称为黄芪苷)和槲皮苷如果以混合标准品的形式注入高效液相色谱仪，采用如下的色谱条件：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：乙腈(A)和0.1％磷酸水溶液(B)，采用梯度洗脱：0-60min，10％～35％A，其余为B；紫外检测器，检测波长：360nm。结果在保留时间27.3min左右仅出现了一个色谱峰(具体见图1A和图1B)。说明上述色谱条件无法实现紫云英苷和槲皮苷的分离。如果将上述条件应用于以黄酮类化合物为活性成分的中药材及其提取物和制剂的质量控制，则会造成检测结果不准确。因此，有必要对黄酮类化合物的高效液相色谱条件做进一步研究，使得各个相近似的成分能够实现分离，达到检测的要求。另外，中药成分复杂、功效多的作用特点使得利用单一成分难以全面评价中药质量，因此多成分多指标的控制方式成为必然的趋势，但是这种质量控制方式却又带来了检测费用高昂和操作繁琐等问题(王智民，等.一测多评法建立的技术指南[J].中国中药杂志，2011，36(6)：657-658)。研究人员发现，不同物质之间在紫外检测器中的响应-浓度比的比值是一个常数，并将该常数定义为相对校正因子(罗祖良，等.相对校正因子在中药多指标测定中的应用研究进展[J].中草药，2012，43(7)：1448-1452)。在进行多指标质量评价时，以药材中某一典型组分(如有对照品供应者)为内标化合物，建立其他组分与该内标化合物之间的相对校正因子后，就可以通过该相对校正因子计算出其他组分的含量。这种只通过测定一个成分，实现同时对多个成分定量的方法命名为一测多评法。近年来，一测多评技术已成功运用于一些常见中药的多种成分含量测定中，如蓝天凤等报道了利用一测多评法测定丹参中4中丹参酮类成分(蓝天凤，等.一测多评法测定丹参中4种丹参酮类成分[J].中草药，2012，43(12)：2420-2423)。但是一测多评法测定的基础仍然是在适当的条件下能够使所检测的成分实现较好的分离。柿叶为柿科植物柿(DiospyroskakiThunb.)的叶，主要含有多种黄酮类化合物，具有止咳定喘，生津止渴，活血止血之功效。以单味柿叶的提取物加工制成的脑心清片有活血化瘀、通络的功效，用于脉络淤阻，眩晕头痛，肢体麻木，胸痹心痛，胸中憋闷，心悸气短；冠心病，脑动脉硬化症见上述症候者。现行《中国药典》脑心清片和柿叶提取物的含量测定项下仅采用HPLC测定经盐酸水解后的槲皮素和山柰酚两个苷元的总量作为质控指标，对脑心清片或其中间体(柿叶提取物)尚未建立完善的质量控制方法。现有技术中，虽然有基于HPLC法同时测定柿叶及其提取物和制剂中多个黄酮类成分的报道。但是尚未有同时测定紫云英苷和槲皮苷的技术。如安淼等报道了同时测定芦丁、山柰素、异鼠李素、槲皮素、异槲皮苷、紫云英苷(安淼，等.同时测定6种柿叶黄酮类物质方法的建立[J].山东农业科学，2016，48(5)：131-136)；张梦雨等同时测定了脑心清原料药及其片剂中原儿茶酸、金丝桃苷、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(即紫云英苷)、山柰酚-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷、杨梅素、槲皮素、柚皮素和山柰酚8种成分(张梦雨，等.高效液相色谱-质谱联用法同时测定脑心清原料药浸膏及其片剂中的8种有效成分[J].色谱，2016，34(8)：773-777)；中国专利技术专利申请，“一种柿叶提取物中黄酮类有效成分的定性”披露了，采用高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪检测牡荆素、金丝桃苷、黄芪苷、三叶豆苷、杨梅素、槲皮素和/或山柰酚(公开号CN106706788A，公开日2017年5月24日)。原因可能是上述研究采用的色谱条件未能将紫云英苷和槲皮苷分离开。而且这些方法均是依据外标法，需要多个相应的标准品，分别建立各个成分的标准曲线，操作繁琐、费时、检测成本高，不适用于工业化生产质量控制的要求。
技术实现思路
针对现有技术的不足，基于高效液相色谱法，本专利技术提供一种分离结构近似的黄酮类成分的方法。本专利技术的方法首次实现了槲皮苷和紫云英苷的分离。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用了如下的技术方案：一种分离结构近似的黄酮类成分的方法，所述方法基于高效液相色谱法，所述结构近似的黄酮类成分包括紫云英苷和槲皮苷；所述高效液相法的色谱条件为：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.05％～0.5％(体积百分比)磷酸水溶液，采用梯度洗脱：0-40min，7％～25％A，其余为B；40-60min，25％～50％A，其余为B；流速：0.5～3.0mL/min；优选为1.0～1.2mL/min；更优选为1.0mL/min；检测波长：200～400nm；优选为360nm；柱温：25～35℃；优选为30℃；进样量：2～20μL；优选为10μL。优选的，所述流动相B为0.1％(体积百分比)磷酸水溶液。优选的，所述结构近似的黄酮类成分还包括金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和山柰酚中的一种或多种。本专利技术的另一个目的在于提供上述方法在检测柿叶提取物或其制剂中黄酮类成分中的应用。优选的，所述检测是指定性检测和/或定量检测。优选的，上述应用基于一测多评法，内标化合物选自槲皮素、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、山柰酚和紫云英苷中的一种。优选的，上述应用，还包括以下步骤：I.相对校正因子的建立，具体操作为：I-1.系列混合对照品溶液的制备分别精密称取包括所述内标化合物的黄酮类成分的对照品，置于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得到混合对照品储备液；分别精密吸取一系列不同体积的所述混合对照品储备液置于容量瓶中，甲醇稀释至刻度线，摇匀，即得系列混合对照品溶液，备用；I-2.相对校正因子fk/s的计算取步骤I-1制备得到的系列混合对照品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，在所述的色谱条件下进行测定，获得色谱图并进行峰面积积分，分别计算所述内标化合物对除内标化合物外的其它黄酮类成分的相对校正因子fk/s，取平均值；II.供试品溶液的制备：取柿叶提取物或柿叶提取物制剂，精密称定，加入甲醇，超声提取，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；III.内标化合物标准溶液的制备：取所述内标化合物，精密称定，加入置于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得；IV.测定取步骤II制备得到的供试品溶液和步骤III制备的内标化合物标准溶液10μL，分别注入高效液相色谱，在所述色谱条件下进行测定，获得色谱图并进行峰面积积分，先用外标法计算出所述内标化合物在供试品本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离结构近似的黄酮类成分的方法，所述方法基于高效液相色谱法，所述结构近似的黄酮类成分包括紫云英苷和槲皮苷；所述高效液相法的色谱条件为：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.05％～0.5％(体积百分比)磷酸水溶液，采用梯度洗脱：0‑40min，7％～25％A，其余为B；40‑60min，25％～50％A，其余为B；流速：0.5～3.0mL/min；优选为1.0～1.2mL/min；更优选为1.0mL/min；检测波长：200～400nm；优选为360nm；柱温：25～35℃；优选为30℃；进样量：2～20μL；优选为10μL；优选的，所述流动相B为0.1％(体积百分比)磷酸水溶液。

【技术特征摘要】
1.一种分离结构近似的黄酮类成分的方法，所述方法基于高效液相色谱法，所述结构近似的黄酮类成分包括紫云英苷和槲皮苷；所述高效液相法的色谱条件为：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.05％～0.5％(体积百分比)磷酸水溶液，采用梯度洗脱：0-40min，7％～25％A，其余为B；40-60min，25％～50％A，其余为B；流速：0.5～3.0mL/min；优选为1.0～1.2mL/min；更优选为1.0mL/min；检测波长：200～400nm；优选为360nm；柱温：25～35℃；优选为30℃；进样量：2～20μL；优选为10μL；优选的，所述流动相B为0.1％(体积百分比)磷酸水溶液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结构近似的黄酮类成分还包括金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和山柰酚中的一种或多种。3.权利要求1或2所述方法在检测柿叶提取物或其制剂中黄酮类成分中的应用；优选的，所述检测是指定性检测和/或定量检测。4.根据权利要求3所述的应用优选的，所述应用基于一测多评法，内标化合物选自槲皮素、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、山柰酚、紫云英苷中的一种。5.一种基于一测多评法测定柿叶提取物或其制剂中黄酮类成分含量的方法，所述方法基于权利要求1或2所述的方法，内标化合物选自槲皮素、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、杨梅素、山柰酚、紫云英苷中的一种；包括以下步骤：I.相对校正因子的建立，具体操作为：I-1.系列混合对照品溶液的制备分别精密称取包括所述内标化合物的黄酮类成分的对照品，置于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得到混合对照品储备液；分别精密吸取一系列不同体积的所述混合对照品储备液置于容量瓶中，甲醇稀释至刻度线，摇匀，即得系列混合对照品溶液，备用；I-2.相对校正因子fk/s的计算取步骤I-1制备得到的系列混合对照品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，在如权利要求1中所述的色谱条件下进行测定，获得色谱图并进行峰面积积分，分别计算...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭海彪，苏诗韵，李楚源，王德勤，李淑如，
申请(专利权)人：广州白云山和记黄埔中药有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44