一种快速无损检测三角褐指藻胞内岩藻黄素的方法技术

本发明专利技术涉及一种快速无损检测三角褐指藻胞内岩藻黄素的方法。本发明专利技术实现了三角褐指藻胞内岩藻黄素的快速无损检测，极大地简化了检测步骤，在建立标准曲线后，检测样品时无需对样品进行提取操作，样品前处理简单，缩短了检测时间，同时非常适宜用于微藻细胞尤其是三角褐指藻细胞内岩藻黄素的快速无损检测分析。

A rapid and nondestructive method for detecting fucoidin in the cells of S. trigonoda

The invention relates to a rapid non-destructive method for detecting fucoidin in the cells of S. The invention realizes the rapid nondestructive testing of cytosolic fuciflavin in the cytosolic fucoida, and greatly simplifies the detection procedure. After establishing the standard curve, the sample is not extracted when the sample is detected. The sample pretreatment is simple and the detection time is shortened. At the same time, it is very suitable for microalgae cells, especially the brown fucoidus. The rapid and nondestructive analysis of intracellular fucoidin.

【技术实现步骤摘要】
一种快速无损检测三角褐指藻胞内岩藻黄素的方法
本专利技术属于微藻胞内色素的快速无损检测技术，特别涉及一种基于荧光检测技术的快速无损检测三角褐指藻胞内岩藻黄素的方法。
技术介绍
岩藻黄素是一种参与光合作用的类胡萝卜素，占自然界总类胡萝卜素的10％以上，广泛存在于褐藻、硅藻和金藻等藻类中。岩藻黄素在藻类细胞中与叶绿素和蛋白组合成一个FCP复合体，在光合作用的光捕获、光能传递、光保护等生理作用中扮演重要的角色。岩藻黄素具有一个独特的丙二烯结构和5,6-环氧结构(化学结构式如下)，区别于其他常见的类胡卜素(如β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素等)。研究证明，岩藻黄素具有显著的抗氧化、消炎、抗癌、减肥等医学功效，并对治疗糖尿病、保肝护肝、抗辐射、保护皮肤、抑制血管增生、脑血管疾病治疗、骨骼保护、保护视力、和抗疟疾等方面具有显著疗效。岩藻黄素强大的抗氧化性能被证明是以食用褐藻中DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼)清除自由基的形式体现的。海洋硅藻(尤其是三角褐指藻)在混合营养连续培养条件下生物量可高达10g·L-1～25g·L-1，经诱导后积累的天然岩藻黄素约占干重的1.5～3％，其含量高于远远高于大型海藻，是岩藻黄素的新来源，安全无毒，有利于降低生产成本。目前分析测定岩藻黄素的传统方法是高效液相色谱法(HPLC)、紫外光检测法(UV)。HPLC法样品干燥、提取、分析流程时间长，用于岩藻黄素的生产工艺和质量控制费时费力。由于通常岩漠黄质样品自身含有大量的杂色素，而UV法前处理方法又过于简洁，没有对杂色素的干扰采取任何相应的预处理措施，因此存在很大的局限性。开发一种可提高检测效率、简化检测工序、杂色素干扰少的三角褐指藻岩藻黄素检测方法非常有必要。
技术实现思路
针对现有技术的以上缺陷，本专利技术提供一种快速无损检测三角褐指藻胞内岩藻黄素的方法，该方法检测速度快，检测工序简单，且杂色素干扰少。本专利技术的技术目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术所述的快速无损检测三角褐指藻胞内岩藻黄素的方法,包括如下步骤：S1：建立标准曲线：取含量已知的三角褐指藻悬浮液已知样品，重悬从所述已知样品中收集的藻细胞，调整重悬液中藻细胞的细胞密度，用流式细胞仪检测藻细胞在533nm或585nm发射波长下的平均荧光强度值；将所述三角褐指藻悬浮液样品的岩藻黄素含量的对数值和相应测得的平均荧光强度值的对数值作线性回归,即得标准曲线；S2：制备待测样品：重悬从待测三角褐指藻悬浮液样品中收集的藻细胞成待测品重悬液，调整所述待测品重悬液中藻细胞的细胞密度，即得待测样品；S3:用流式细胞仪检测待所述待测样品中藻细胞在在533nm(FL1通道)或585nm(FL2通道)发射波长下的平均荧光强度值，根据步骤S1建立的标准曲线，计算所述待测样品中的岩藻黄素含量。本专利技术优选地，所述步骤S1和S2中藻细胞的细胞密度均需调整至6×105～2×106CFU/mL之间。本专利技术具地，所述步骤S1中，在533nm发射波长下的平均荧光强度值，获得的线性回归曲线为Y＝2.2378X–7.1675(R2＝0.8787)，Y表示三角褐指藻胞内岩藻黄素含量(mg/g干燥粉)的常用对数值，X表示流式细胞术测定在533nm发射波长下的平均荧光强度的常用对数值；在585nm发射波长下的平均荧光强度值，获得的线性回归曲线为Y＝2.438X–6.3187(R2＝0.9267)，Y表示三角褐指藻胞内岩藻黄素含量(mg/g干燥粉)的常用对数值，X表示流式细胞术测定在585nm发射波长下的平均荧光强度的常用对数值。本专利技术更具体地，所述步骤S1和S2中重悬采用磷酸盐缓冲液，其浓度为10mM，pH为6.8～7.6。本专利技术更具体地，，所述流式细胞仪在检测样品的荧光强度值时的进样流速在14～100uL/min之间；优选流速为35uL/min。更进一步地，所述步骤S1中的已知样品及步骤S2中待测样品在用流式细胞仪检测前还需用孔径5～40μm的水相滤膜或有机相滤膜过滤；所述步骤S1和S3中的对数值是以10为底的对数。本专利技术具体地，所述步骤S1中所述已知样品的岩藻黄素含量采用HPLC法或紫外可见分光光度计法测定。本专利技术更具体地，所述步骤S1中已知样品的岩藻黄素含量通过HPLC法测定,包括以下测定步骤：a)、已知样品的峰面积测定：将三角褐指藻悬浮液样品冻干为藻粉,从所述藻粉中提取获得岩藻黄素提取物,用甲醇和甲基叔丁基醚按照体积比1：9～9:1混合后溶解所述岩藻黄素提取物，然后用高效液相仪测定其液相峰面积；b)、建立HPLC法标准曲线：用甲醇和甲基叔丁基醚按照体积比1：9～9:1的混合溶剂将岩藻黄素标准品配制若干浓度梯度的岩藻黄素标准品溶液，测定所述若干个浓度梯度的岩藻黄素标准品溶液的液相峰面积，将标准溶液的液相峰面积与相应的标准品溶液浓度做线性回归，绘制HPLC法标准曲线；c)、根据步骤b)中建立的HPLC法标准曲线,计算步骤a)测定的已知样品的峰面积所对应的已知样品的岩藻黄素含量。更进一步地，所述步骤a)中，用液相色谱仪检测时，柱温箱温度为25～35℃，洗脱液流速控制为0.5～1.5mL/min；所述液相色谱仪还配备有PDA检测器，在检测时，检测器在440nm进行岩藻黄素的检测，同时在300～800nm对样品进行全波长扫描；液相色谱检测条件：检测波长为440nm，色谱柱为YMCTMC30；甲醇、甲基叔丁基醚分别为流动相A、B，以流动相A、B组成的洗脱液进行梯度洗脱，流动相梯度洗脱程序及各流动相的体积百分比为：0～6min，流动相A95％→80％，流动相B5％→20％；6～12min，流动相A80％→60％，流动相B20％→40％；12～19min，流动相A60％→55％，流动相B40％→45％；19～20min，流动相A55％→95％，流动相B45％→5％；20～23min，流动相A95％，流动相B5％。本专利技术更进一步地，所述步骤a)中岩藻黄素提取物通过如下步骤获得：a1)、将藻粉加入甲醇和丙酮1：9～9:1混合提取溶剂中，振荡，冷却，离心收集上清液；a2)、所得沉淀加入至所述混合提取溶剂中，振荡，置于冷却，离心收集上清液；a3)、重复该步骤a2)直至藻粉呈无色为止合并所有上清液，用氮气吹干。与现有的岩藻黄素的含量检测技术相比较，本专利技术具有以下显著优点：本专利技术实现了三角褐指藻胞内岩藻黄素的快速无损检测，极大地简化了检测步骤，在建立标准曲线后，检测样品时无需对样品进行提取操作，样品前处理简单，缩短了检测时间，同时非常适宜用于微藻细胞尤其是三角褐指藻细胞内岩藻黄素的快速无损检测分析。附图说明图1为本专利技术所述的三角褐指藻(P.tricornutum)在不同条件下培养过程中干重的变化情况。图2为本专利技术所述的三角褐指藻(P.tricornutum)在不同条件下培养过程中OD值的变化情况。图3为本专利技术所述的三角褐指藻(P.tricornutum)在不同条件下培养过程中细胞密度的变化情况。图4为本专利技术所述的三角褐指藻(P.tricornutum)的荧光光谱图。图5为本专利技术所述的三角褐指藻(P.tricornutum)在不同条件下培养过程中FL1(533nm)平均荧光强度值的变化情况。图6为本专利技术所述的三角褐指藻(P.tricorn本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速无损检测三角褐指藻胞内岩藻黄素的方法,其特征在于,包括如下步骤：S1：建立标准曲线：取含量已知的三角褐指藻悬浮液已知样品，重悬从所述已知样品中收集的藻细胞，调整重悬液中藻细胞的细胞密度，用流式细胞仪检测藻细胞在533nm或585nm发射波长下的平均荧光强度值；将所述三角褐指藻悬浮液样品的岩藻黄素含量的对数值和相应测得的平均荧光强度值的对数值作线性回归,即得标准曲线；S2：制备待测样品：重悬从待测三角褐指藻悬浮液样品中收集的藻细胞成待测品重悬液，调整所述待测品重悬液中藻细胞的细胞密度，即得待测样品；S3:用流式细胞仪检测待所述待测样品中藻细胞在在533nm或585nm发射波长下的平均荧光强度值，根据步骤S1建立的标准曲线，计算所述待测样品中的岩藻黄素含量。

【技术特征摘要】
1.一种快速无损检测三角褐指藻胞内岩藻黄素的方法,其特征在于,包括如下步骤：S1：建立标准曲线：取含量已知的三角褐指藻悬浮液已知样品，重悬从所述已知样品中收集的藻细胞，调整重悬液中藻细胞的细胞密度，用流式细胞仪检测藻细胞在533nm或585nm发射波长下的平均荧光强度值；将所述三角褐指藻悬浮液样品的岩藻黄素含量的对数值和相应测得的平均荧光强度值的对数值作线性回归,即得标准曲线；S2：制备待测样品：重悬从待测三角褐指藻悬浮液样品中收集的藻细胞成待测品重悬液，调整所述待测品重悬液中藻细胞的细胞密度，即得待测样品；S3:用流式细胞仪检测待所述待测样品中藻细胞在在533nm或585nm发射波长下的平均荧光强度值，根据步骤S1建立的标准曲线，计算所述待测样品中的岩藻黄素含量。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤S1和S2中藻细胞的细胞密度均需调整至6×105～2×106CFU/mL之间。3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步骤S1中，在533nm发射波长下的平均荧光强度值，获得的线性回归曲线为Y＝2.2378X–7.1675(R2＝0.8787)，Y表示三角褐指藻胞内岩藻黄素含量(mg/g干燥粉)的常用对数值，X表示流式细胞术测定在533nm发射波长下的平均荧光强度的常用对数值；在585nm发射波长下的平均荧光强度值，获得的线性回归曲线为Y＝2.438X–6.3187(R2＝0.9267)，Y表示三角褐指藻胞内岩藻黄素含量(mg/g干燥粉)的常用对数值，X表示流式细胞术测定在585nm发射波长下的平均荧光强度的常用对数值。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S1和S2中重悬采用磷酸盐缓冲液，其浓度为10mM，pH为6.8～7.6。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述流式细胞仪在检测样品的荧光强度值时的进样流速在14～100μL/min之间；优选流速为35μL/min。6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中的已知样品及步骤S2中待测样品在用流式细胞仪检测前还需用孔径5～40μm的水相滤膜或有机相滤膜过滤；所述步骤S1和S3中的对数值是以10为底的对数。7.根据权利要求1所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏东，宋培钦，杨润青，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44