本发明专利技术涉及树鼩外周血(PB)红细胞裂解方法。其通过 BD Pharm LyseTM两次裂解树鼩全血，并对裂解条件即裂解时间、裂解次数以及裂解液与全血的体积比进行了优化，建立了优化的用于树鼩外周血细胞免疫表型分析的红细胞裂解方案，为进一步研究树鼩实验动物的免疫系统和免疫应答的评估提供了重要的技术平台。
Cell immunophenotype analysis of tree shrew and peripheral blood red cell lysis
The invention relates to a method for splitting red blood cells of tree shrew peripheral blood (PB). The whole blood of the tree shrew was divided by BD Pharm LyseTM, and the lysis time, the number of lysate and the volume ratio of the lysate with the whole blood were optimized. The optimized red cell lysis scheme was established for the analysis of the peripheral blood cell immunophenotype of tree shrews, and the immune system of the tree shrew experimental animals was studied in a further step. And the evaluation of immune response provides an important technology platform.
【技术实现步骤摘要】
树鼩细胞免疫表型分析中外周血红细胞裂解方法
本专利技术涉及生物免疫相关领域，具体涉及外周血红细胞裂解方法，更具体涉及树鼩细胞免疫表型分析中外周血红细胞裂解方法。
技术介绍
树鼩是一种新兴的实验动物[1,2]，其在人类疾病动物模型的研究中，越来越受到了科学家们的重视，包括传染性病[3]、代谢疾病[4]、神经疾病[5]和癌症[6]。然而，由于缺乏商业化的试剂，使得我们对树鼩的细胞表型认识非常有限，这些阻碍了树鼩作为实验动物的开发应用。在临床和动物模型研究中，流式细胞分析是研究宿主对病原体或抗原反应、造血系统疾病、免疫相关疾病和干细胞等的基本方法之一。红细胞裂解是外周血流式细胞分析中的一个重要环节，尽管在临床分析中对于一些抗体来说其不是必须的，但裂解红细胞后再对其进行分析不仅节省了抗体，而且对外周血的免疫表型分析结果也是很关键的[7]。在本研究中，我们评价了四种商业化或文献报道的试剂对树鼩外周血红细胞裂解的效果，并对红细胞裂解方法和条件进行了优化，获得了最佳的树鼩外周血红细胞裂解方法，并通过流式细胞术分析免疫表型进行了验证。尽管许多用于红细胞裂解的试剂可以在市场上可以买到，但它们通过不同的机制发挥作用，并显示出不同的红细胞裂解效果[8]。此外，目前没有关于树鼩外周血红细胞裂解试剂的报道，以及尚未确定树鼩红细胞裂解的最佳方法。参考文献1YaoYG.Creatinganimalmodels,whynotusetheChinesetreeshrew(Tupaiabelangerichinensis)ZoolRes2017,38:118-1262XiaoJ,LiuR,ChenCS.Treeshrew(Tupaiabelangeri)asanovellaboratorydiseaseanimalmodel.ZoolRes2017,38:127-1373Zi-fengYangJZ,Yu-tongZhu,Yu-taoWang,RongLiu,Sui-shanZhao,Run-fengLi,Chun-guangYang,Ji-qiangLiandNan-shanZhong.ThetreeshrewprovidesausefulalternativemodelforthestudyofinfluenzaH1N1virus.2013,VirologyJournal:1-94WuX,XuH,ZhangZ,ChangQ,LiaoS,ZhangL,LiY,etal.TranscriptomeProfilesUsingNext-GenerationSequencingRevealLiverChangesintheEarlyStageofDiabetesinTreeShrew(Tupaiabelangerichinensis).JDiabetesRes2016,2016:62385265SonnayS,PoirotJ,JustN,ClercAC,GruetterR,RainerG,DuarteJMN.Astrocyticandneuronaloxidativemetabolismarecoupledtotherateofglutamate-glutaminecycleinthetreeshrewvisualcortex.Glia20176YeL,HeM,HuangY,ZhaoG,LeiY,ZhouY,ChenX.Treeshrewasanewanimalmodelforthestudyoflungcancer.Oncologyletters2016,11:2091-20957EinwallnerE,SubasicA,StrasserA,AugustinD,ThalhammerR,SteinerI,SchwarzingerI.Lysismatters:redcelllysiswithFACSLyseaffectstheflowcytometricenumerationofcirculatingleukemicblasts.Journalofimmunologicalmethods2013,390:127-1328BossuytX,MartiGE,FleisherTA.Comparativeanalysisofwholebloodlysismethodsforflowcytometry.Cytometry1997,30:124-1339PanQ,YeL,DengZ,LiL,LiuH.EffectsofredbloodcelllysingsolutionsonthedetectionofperipheralbasophilsofhealthynormalsandSLEpatientsbyflowcytometry.JImmunoassayImmunochem2014,35:368-37710DesmeulesP,DufourM,FernandesMJ.Arapidflowcytometryassayfortheassessmentofcalciummobilizationinhumanneutrophilsinasmallvolumeoflysedwhole-blood.Journalofimmunologicalmethods2009,340:154-15711StabelTJ,BolinSR,PeschBA,RahnerTE.Asimpleandrapidflowcytometricmethodfordetectionofporcinecellsurfacemarkers.Journalofimmunologicalmethods2000,245:147-152。
技术实现思路
本专利技术评价和比较了四种试剂和方案对树鼩外周血红细胞裂解的有效性，选择出最有效的裂解试剂进行裂解条件的优化，从而得到最有效的树鼩外周血红细胞裂解方法。本专利技术提供的技术方案是：一种树鼩外周血红细胞裂解方法，该方法包括如下步骤：1）从树鼩尾静脉采集全血；2）将8-12倍体积的1xBDPharmLyseTM加入到树鼩全血中；3）立即进行轻柔涡旋混匀；4）在室温下避光孵育10-20分钟；5）室温于180-220离心，离心时间5分钟；6）吸去上清液，不破坏沉淀；7）用与初始全血相同体积的染色缓冲液重悬细胞沉淀；8）加入以上细胞悬液8-12体积的1xBDPharmLyseTM；9）立即进行轻柔涡旋混匀；10）室温避光孵育3-7分钟；11）室温于180-220离心，离心时间5分钟；12）吸去上清液，不要打散沉淀；13）用染色缓冲液重悬沉淀备用。优选地，所述的染色缓冲液，其组分为含0.1％BSA和0.01％NaN3的PBS。优选地，第5步或第10步的离心为203g离心，离心时间5分钟。优选地，第4步是在室温下避光孵育为15分钟。优选地，第10步是在室温下避光孵育为5分钟。优选地，第2步是将10倍体积的1xBDPharmLyseTM加入到含有树鼩全血中。优选地，所述的BDPharmLyseTM具体编号为Cat#:555899。本专利技术建立了一个优化的用于树鼩PB细胞免疫表型分析的红细胞裂解方案，既能有效地去除红细胞，又能最大限度地保证外周血单核细胞的活性，且完全适用于树鼩外周血的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种树鼩外周血红细胞裂解方法，其特征在于：包括如下步骤：从树鼩尾静脉采集全血；2）将8‑12倍体积的1x BD Pharm LyseTM加入到树鼩全血中；3）立即进行轻柔涡旋混匀；4）在室温下避光孵育10‑20分钟；5）室温于180‑220离心，离心时间5分钟；6）吸去上清液，不破坏沉淀；7）用与初始全血相同体积的染色缓冲液重悬细胞沉淀；8）加入以上细胞悬液8‑12体积的1x BD Pharm LyseTM；9）立即进行轻柔涡旋混匀；10）室温避光孵育3‑7分钟；11）室温于180‑220离心，离心时间5分钟；12）吸去上清液，不要打散沉淀；13）用染色缓冲液重悬沉淀备用。
【技术特征摘要】
1.一种树鼩外周血红细胞裂解方法，其特征在于：包括如下步骤：从树鼩尾静脉采集全血；2）将8-12倍体积的1xBDPharmLyseTM加入到树鼩全血中；3）立即进行轻柔涡旋混匀；4）在室温下避光孵育10-20分钟；5）室温于180-220离心，离心时间5分钟；6）吸去上清液，不破坏沉淀；7）用与初始全血相同体积的染色缓冲液重悬细胞沉淀；8）加入以上细胞悬液8-12体积的1xBDPharmLyseTM；9）立即进行轻柔涡旋混匀；10）室温避光孵育3-7分钟；11）室温于180-220离心，离心时间5分钟；12）吸去上清液，不要打散沉淀；13）用染色缓冲液重悬沉淀备用。2.如权利要求1所述的树鼩外周血红细胞裂解方法，其特征在于：所...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘红旗，李昕潼，陶玉芬，陆巍，刘建生，代解杰，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53
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