一种区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的分子标记、试剂盒及区分方法技术

一种区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的分子标记、试剂盒及区分方法，它涉及区分鲂属鱼类的分子标记及其应用。分子标记的引物对为HLJFLf1和HLJFLr1。试剂盒包括分子标记引物对HLJFLf1和HLJFLr1。区分方法为：一、提取鳍条DNA；二、以HLJFLf1和HLJFLr1为引物进行PCR扩增；三、利用限制性内切酶TaqI对PCR产物进行酶切；四、电泳检测，电泳结果出现200bp和180bp双条带的对应个体为黑龙江三角鲂。本发明专利技术方法可在未发生杂交的情况下快速、高效、稳定区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的代表性地理种群。

Molecular marker, kit and distinguishing method for distinguishing Heilongjiang triangular bream and southern bream fish

A molecular marker, kit and differentiation method to distinguish between Heilongjiang and southern bream. It involves the molecular marker and its application to distinguish the fishes of bream. The primer pairs of molecular markers were HLJFLf1 and HLJFLr1. The kit consists of molecular marker primers for HLJFLf1 and HLJFLr1. The method of differentiation is: first, the fin strip DNA is extracted; two, HLJFLf1 and HLJFLr1 are used as primers for PCR amplification; three, the restriction endonuclease TaqI is used to cut the PCR products; four, electrophoresis detection, the corresponding individual of 200bp and 180bp double bands is the corresponding individual of Heilongjiang bream. The method can rapidly, efficiently and steadily distinguish the representative geographic populations of Heilongjiang bream and southern bream in the absence of hybridization.

【技术实现步骤摘要】
一种区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的分子标记、试剂盒及区分方法
本专利技术涉及区分鲂属鱼类的分子标记及其应用。
技术介绍
我国现存鲂属鱼类包括4个种，分别为长江上游的厚颌鲂、长江中下游大型湖泊中的团头鲂(武昌鱼)、珠江和海南诸水系的广东鲂和广泛分布多个水系的三角鲂。目前，三角鲂现存3个代表性地理种群，分别为钱塘江三角鲂、长江三角鲂和黑龙江三角鲂。黑龙江三角鲂是黑龙江流域特有的名鱼“三花五罗”中的“法罗”，也是黄河以北唯一自然分布的鲂属鱼类。作为当地中大型经济名鱼，该鱼抗逆性强、脂高味美，开发潜力巨大；另一方面，长期地理隔离和独特生境可能使其蕴藏未来鲂属鱼类育种所需的关键基因或标记。但遗憾的是，长期酷捕和污染已使栖息在松花江、嫩江、镜泊湖和兴凯湖的种群绝迹多年，现每年仅在中俄界江黑龙江抚远江段可见少量个体。相对于南方鲂属鱼类一般3年可达性成熟来说，黑龙江三角鲂需5年方能初繁，高强度捕捞和缓慢的群体补充可能使其彻底灭绝。综上可见，黑龙江三角鲂的种质资源保护已刻不容缓。鲂属不同种类形态均极为相似，特别在性成熟前的早期生长阶段。从现有的形态学研究看，还缺乏直观、明显的差异来区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类。在人工繁殖抢救濒危黑龙江三角鲂资源时，为保证采捕亲鱼的种质纯度，须建立快速准确的鉴定方法，这对于保护和开发这一名贵的地方种质资源具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的分子标记、试剂盒及区分方法。本专利技术区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的分子标记的引物对为HLJFLf1和HLJFLr1，具体序列为：HLJFLf1：5′-GCATCTGGCTTCAATCTCA-3′HLJFLr1：5′-GATTTGCTGAGCGTAGGG-3′。本专利技术区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的试剂盒包括分子标记引物对HLJFLf1和HLJFLr1。进一步，上述试剂盒还包括10×TaqBuffer、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶、RE缓冲液10×Buffer、牛血清白蛋白BSA和TaqI内切酶。本专利技术还提供上述分子标记在区分鉴定黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类中的应用。具体方法如下：一、提取待测鲂属鱼类鳍条的基因组DNA，备用；二、以提取的基因组DNA为模板，以HLJFLf1和HLJFLr1为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；三、利用限制性内切酶TaqI对PCR产物进行酶切；四、用1.5％的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳检测，电泳结果出现200bp和180bp双条带的对应个体为黑龙江三角鲂，未出现200bp和180bp双条带的个体非黑龙江三角鲂，即完成区分鉴定。步骤二中所述HLJFLf1和HLJFLr1的具体序列为：HLJFLf1：5′-GCATCTGGCTTCAATCTCA-3′HLJFLr1：5′-GATTTGCTGAGCGTAGGG-3′。本专利技术的有益效果：本专利技术方法可在未发生杂交的情况下快速、高效、稳定区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的代表性地理种群(钱塘江三角鲂、长江三角鲂、梁子湖团头鲂、伊河团头鲂、龙溪河厚颌鲂和西江广东鲂)。采用本专利技术提供的分子标记及方法，可直接对黑龙江三角鲂和南方鲂属鱼类进行区分、鉴定。该方法的准确性高、操作过程简洁、用时短，准确率达到100％。附图说明图1为实施例1的电泳结果图。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的分子标记的引物对为HLJFLf1和HLJFLr1，具体序列为：HLJFLf1：5′-GCATCTGGCTTCAATCTCA-3′HLJFLr1：5′-GATTTGCTGAGCGTAGGG-3′。具体实施方式二：本实施方式分子标记在区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类中的应用。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：分子标记用于区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的具体方法为：一、提取待测鲂属鱼类鳍条的基因组DNA，备用；二、以提取的基因组DNA为模板，以HLJFLf1和HLJFLr1为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；三、利用限制性内切酶TaqI对PCR产物进行酶切；四、用1.5％的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳检测，电泳结果出现200bp和180bp双条带的对应个体为黑龙江三角鲂，未出现200bp和180bp双条带的个体非黑龙江三角鲂，即完成区分鉴定；其中HLJFLf1核苷酸序列为：5′-GCATCTGGCTTCAATCTCA-3′HLJFLr1核苷酸序列为：5′-GATTTGCTGAGCGTAGGG-3′。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中PCR扩增体系如下：PCR扩增条件：94℃变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三酶切反应体系如下：酶切条件：65℃水浴酶切2h。其它与具体实施方式一相同。下面对本专利技术的实施例做详细说明，以下实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1：本实施例选择的实验样品为黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的代表性地理种群(钱塘江三角鲂、长江三角鲂、梁子湖团头鲂、伊河团头鲂、龙溪河厚颌鲂和西江广东鲂)。使用以下方法验证本专利技术的分子标记用于区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的准确性。一、提取待测鲂属鱼类鳍条的基因组DNA，备用；具体方法如下：(1)取待鉴定的样品的鳍条组织(每尾约60mg)，剪碎后置于1.5mLEP管内，加入600μL组织提取液和10μL蛋白酶K，在56℃150rpm的摇床上消化过夜；(2)加入600μLTris饱和酚上下颠倒10分钟，然后12000rpm离心10分钟，取上层水相，加入等体积酚-氯仿-异戊醇(24:23:1)，混合10分钟；(4)12000rpm离心10分钟，取上层水相，加入等体积氯仿-异戊醇(23:1)，混合10分钟；(5)12000rpm离心10分钟，取上层水相，加入2倍体积的无水冰乙醇(-20℃保存)，水平摇动，直到出现白色絮状物；(6)10000rpm离心10分钟，管底可见白色DNA沉淀，用牙签将沉淀挑入装有500μL体积浓度70％冰乙醇的1.5mLEP管，8000rpm离心5分钟，倒掉乙醇，自然干燥；(7)加适量的TE缓冲液，置于55℃的水浴锅中溶解DNA4小时，将其置-20℃保存备用。二、以提取的基因组DNA为模板，以HLJFLf1和HLJFLr1为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；HLJFLf1：5′-GCATCTGGCTTCAATCTCA-3′HLJFLr1：5′-GATTTGCTGAGCGTAGGG-3′。三、利用限制性内切酶TaqI对PCR产物进行酶切；四、用1.5％的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳检测，选择电泳结果为双条带分别是200bp和180bp所对应的个体，即完成区分鉴定。步骤二中PCR扩增体系如下：PCR扩增条件：94℃变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的分子标记，其特征在于该分子标记的引物对为HLJFLf1和HLJFLr1，具体序列为：HLJFLf1：5′‑GCATCTGGCTTCAATCTCA‑3′HLJFLr1：5′‑GATTTGCTGAGCGTAGGG‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的分子标记，其特征在于该分子标记的引物对为HLJFLf1和HLJFLr1，具体序列为：HLJFLf1：5′-GCATCTGGCTTCAATCTCA-3′HLJFLr1：5′-GATTTGCTGAGCGTAGGG-3′。2.一种区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括分子标记引物对HLJFLf1和HLJFLr1。3.根据权利要求2所述的一种区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括10×TaqBuffer、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶、RE缓冲液10×Buffer、牛血清白蛋白BSA和TaqI内切酶。4.权利要求1所述分子标记在区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于分子标记用于区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类，具体方法为：一、提取待测鲂属鱼类鳍条的基因组DNA，...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡雪松，石连玉，李池陶，栾培贤，曹春花，贾智英，尚梅，葛彦龙，王世会，张秋军，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23