一种提高植物对双生病毒抗性的方法技术

技术编号:18441073 阅读:17 留言:0更新日期:2018-07-14 06:58
本发明专利技术提供一种改造的抗双生病毒的vTALE分子,和利用编码该分子的重组载体培育具有稳定的广谱双牛病毒抗性的植物的方法。其策略为利用高效改变双生病毒基因组特定区域的表观遗传学修饰从而干扰双生病毒的正常复制及转录过程,达到提高植物对双生病毒的免疫能力的目的。所述vTALE分子以植物病原细菌水稻黄单胞杆菌三型分泌系统效应因子AvrXa27基因序列为骨架序列,保留其N端和C端序列,然后对其DNA识别/结合结构域序列和功能输出结构域序列进行改造,其中所述改造后的DNA识别/结合结构域序列靶向SEQ ID NO:1所示的IR‑vTALE靶点序列或SEQ ID NO:2所示的RB‑vTALE靶点序列,并且所述改造后的功能输出结构域序列选自由编码SEQ ID NOs:8‑12所示的氨基酸序列的核苷酸序列组成的组中的任一种。

A method to improve plant resistance to Gemini virus

The present invention provides a modified vTALE molecule against Gemini virus and a method for cultivating plants with stable broad-spectrum bis virus resistance by encoding the recombinant vector of the molecule. The strategy is to use the epigenetic modification of the specific region of the genome of the Gemini virus to interfere with the normal replication and transcription of the Gemini virus, so as to improve the immunity of the plant to the Gemini virus. The vTALE molecule is the skeleton sequence of the plant pathogenic bacterium Xanthomonas Xanthomonas three secretory system effector AvrXa27 gene, retaining its N and C terminal sequences, and reconstructing the sequence of its DNA identification / binding domain sequence and the functional domain sequence, in which the reconstructed DNA identification / binding domain sequence is described. The IR vTALE target sequence or the RB vTALE target sequence shown by the SEQ ID NO:2 is targeted to the SEQ ID NO:1, and the modified functional output domain sequence selects any of the groups composed of the nucleotide sequences of the amino acid sequence shown in the SEQ ID 12.

【技术实现步骤摘要】
一种提高植物对双生病毒抗性的方法
本专利技术涉及分子生物学领域,特别涉及一种改造的抗双生病毒的vTALE分子,尤其涉及一种对双生病毒科病毒具有广谱抗性且有效稳定的vTALE分子。本专利技术还涉及所述vTALE分子的应用以及利用所述vTALE分子培育具有稳定的广谱双生病毒抗性的植物的方法。
技术介绍
双生病毒(Geminivirus)为孪生颗粒形态的单链DNA病毒,病毒颗粒大小约为20×30nm。依据病毒的基因组结构、寄主范围、传播介体以及基因组序列的相关性将双生病毒分为七个属,即菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)、玉米线条病毒属(Mastrevirus)、甜菜曲顶病毒属(Curtovirus)、番茄伪曲顶病毒属(Topocuvirus)、伊朗甜菜曲顶病毒属(Becurtovirus)、芜菁曲顶病毒属(Turncurtovirus)和弯叶画眉草条纹病毒属(Eragrovirus)。双生病毒高度依赖于寄主植物细胞的DNA复制和RNA转录系统来完成自身的复制和转录过程。在最近20年间,双生病毒引起的病害由局部发生的小病害衍变成目前全球性的最重要的植物病毒病害之一,危害玉米、小麦、棉花、木薯、番茄等重要农作物和经济作物,仅对于木薯,每年在全球造成的经济损失就达数十亿美元之巨。在我国,随着入侵烟粉虱的不断蔓延,导致由其传播的双生病毒病害——番茄黄化曲叶病在18个省市多个番茄产区发生,成为我国番茄生产上最重要的病害之一。2009年经济损失超过50亿元,2010--2012年危害进一步扩大,病害发生面积超过100万亩。因此,对双生病毒病害的有效防治已经成为亟待解决的实际生产问题。目前,在实际生产中仍普遍采用化学防治的方法来直接或者间接地防控双生病毒病害,但效果并不理想,同时化学防治对环境及食品安全也构成了严重的威胁。随着分子生物学的不断发展,科学家们对植物抗双生病毒的分子机制有了进一步的解析,研究较清楚的机制主要有两类:抗性较专一的抗性基因(Rgene)介导的抗性和抗性谱较宽的RNA沉默(RNAsilencing)介导的抗性。利用抗性基因选育抗性品种来防控双生病毒的方法具有育种周期长、抗病谱较窄的弱点,而双生病毒的突变率高、病毒同入侵型介体昆虫形成互惠共生的关系等原因导致该种方法未能快速、有效地发挥防控作用。而利用RNA沉默机制来防控双生病毒的方法由于存在抗性不稳定且易丢失,此外双生病毒同其他病毒一样也进化出了有效的抑制植物RNA沉默的基因沉默抑制子(SuppressorofRNAsilencing),使得该方法也未能在实际生产中得到广泛应用。最近发展出来一种利用CRISPR/Cas技术使植物获得抗双生病毒的新方法。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物,此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA,可以改造形成具有引导作用的sgRNA(shortguideRNA),足以引导Cas9对DNA的定点切割。但是研究表明通过该方法植物获得的对双生病毒的抗性并不稳定且常有脱靶的现象。综上所述,利用分子生物学技术发展一种有效并且抗性稳定的抗双生病毒的新方法对于农作物及经济作物的高产和稳产以及环境和食品的安全都是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种对双生病毒科病毒具有广谱抗性且有效稳定的vTALE分子。本专利技术提供的对双生病毒科病毒具有广谱抗性且有效稳定的vTALE分子是一种改造的抗双生病毒的vTALE分子,其以植物病原细菌水稻黄单胞杆菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,缩写为Xoo)三型分泌系统效应因子AvrXa27基因序列为骨架序列,保留AvrXa27基因的N端和C端序列,然后对AvrXa27基因的DNA识别/结合结构域序列和功能输出结构域序列进行改造而获得。其中改造的部分涉及DNA识别/结合结构域序列和功能输出结构域序列两部分(下文将这两部分分别称为“改造后的DNA识别/结合结构域序列”和“改造后的功能输出结构域序列”)。vTALE分子的DNA识别/结合结构域经人工设计能够特异性地识别并结合任意指定的DNA序列,在功能输出结构域的作用下从而可以实现对靶基因的调控与修饰。通过对双生病毒基因组特定区域进行人工设计的表观遗传学修饰从而干扰双生病毒的正常复制及转录过程,达到提高植物对双生病毒的免疫能力的目的。本专利技术分别针对双生病毒科多株双生病毒高度保守的IR(IntergeneticRegion)区域设计了vTALE靶点IR-vTALE及针对菜豆金色花叶病毒属病毒甘蓝曲叶病毒(Cabbageleafcurlvirus,CaLCuV)复制相关蛋白结合位点(ReplicationassociatedproteinBinding,RepBinding)设计了特异性的RB-vTALE靶点为vTALE的DNA识别/结合结构域的靶点序列,功能输出结构域融合表达表观遗传学修饰相关因子。在第一方面,本专利技术提供一种改造的抗双生病毒的vTALE分子,其以植物病原细菌水稻黄单胞杆菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)三型分泌系统效应因子AvrXa27基因序列为骨架序列,保留AvrXa27基因的N端和C端序列,然后对AvrXa27基因的DNA识别/结合结构域序列和功能输出结构域序列进行改造而获得,其中所述改造后的DNA识别/结合结构域序列靶向SEQIDNO:1所示的IR-vTALE靶点序列或SEQIDNO:2所示的RB-vTALE靶点序列,并且所述改造后的功能输出结构域序列选自由编码SEQIDNOs:8-12所示的氨基酸序列的核苷酸序列组成的组中的任一种。这两部分序列可以通过特异的限制性内切酶处理后连接。本领域技术人员能够选择这两个序列中合适的特异性限制性内切酶酶切位点经限制性内切酶处理后将二者连接在一起。优选地,所述改造后的DNA识别/结合结构域序列靶向IR-vTALE靶点序列,其序列为5’-TAATATTACCGGATGGCC-3’(SEQIDNO:1)。优选地,所述改造后的DNA识别/结合结构域序列靶向RB-vTALE靶点序列,其序列为5’-TATATATTGGACACCAAG-3’(SEQIDNO:2)。优选地,所述改造后的功能输出结构域序列为编码AtKYP(其氨基酸序列为SEQIDNO:8)的核苷酸序列。优选地,所述改造后的功能输出结构域序列为编码AtHDAC19(其氨基酸序列为SEQIDNO:9)的核苷酸序列。优选地,所述改造后的功能输出结构域序列为编码AtMET1(其氨基酸序列为SEQIDNO:10)的核苷酸序列。优选地,所述改造后的功能输出结构域序列为编码AtSRDX(其氨基酸序列为SEQIDNO:11)的核苷酸序列。优选地,所述改造后的功能输出结构域序列为编码AtSUVH2(其氨基酸序列为SEQIDNO:12)的核苷酸序列。优选地,所述改造后的功能输出结构域序列是选自由SEQIDNOs:3-7所示的核苷酸序列组成的组的任意一种核苷酸序列。根据本专利技术第一方面构建的抗双生病毒的本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种改造的抗双生病毒的vTALE分子,其以植物病原细菌水稻黄单胞杆菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)三型分泌系统效应因子AvrXa27基因序列为骨架序列,保留AvrXa27基因的N端和C端序列,然后对AvrXa27基因的DNA识别/结合结构域序列和功能输出结构域序列进行改造而获得,其中所述改造后的DNA识别/结合结构域序列靶向SEQ ID NO:1所示的IR‑vTALE靶点序列或SEQ ID NO:2所示的RB‑vTALE靶点序列,并且所述改造后的功能输出结构域序列选自由编码SEQ ID NOs:8‑12所示的氨基酸序列的核苷酸序列组成的组中的任一种。

【技术特征摘要】
1.一种改造的抗双生病毒的vTALE分子,其以植物病原细菌水稻黄单胞杆菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)三型分泌系统效应因子AvrXa27基因序列为骨架序列,保留AvrXa27基因的N端和C端序列,然后对AvrXa27基因的DNA识别/结合结构域序列和功能输出结构域序列进行改造而获得,其中所述改造后的DNA识别/结合结构域序列靶向SEQIDNO:1所示的IR-vTALE靶点序列或SEQIDNO:2所示的RB-vTALE靶点序列,并且所述改造后的功能输出结构域序列选自由编码SEQIDNOs:8-12所示的氨基酸序列的核苷酸序列组成的组中的任一种。2.权利要求1所述的改造的抗双生病毒的vTALE分子,其中所述改造后的DNA识别/结合结构域序列靶向SEQIDNO:1所示的IR-vTALE靶点序列。3.权利要求1所述的改造的抗双生病毒的vTALE分子,其中所述改造后的DNA识别/结合结构域序列靶向SEQIDNO:2所示的RB-vTALE靶点序列。4.权利要求1所述的改造的抗双生病毒的vTALE分子,其中所述改造后的功能输出结构域序列编码SEQIDNO:8所示的AtKYP蛋白。5.权利要求1所述的改造的抗双生病毒的vTALE分子,其中所述改造后的功能输出结构域序列编码SEQIDNO:9所示的AtHDAC19蛋白。6.权利要求1所述的改造的抗双生病毒的vTALE分子,其中所述改造后的功能输出结...

【专利技术属性】
技术研发人员:叶健孙艳伟
申请(专利权)人:中国科学院微生物研究所
类型:发明
国别省市:北京,11

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