一种体外维持人造血干祖细胞干性的培养基及方法技术

本发明专利技术公开了一种体外维持人造血干祖细胞干性的培养基及方法，所述培养基包含基础培养基和维持小分子组合，所述维持小分子组合为CFO，其中C为CHIR99021、F为Forskolin、O为OAC1。本发明专利技术培养基能够在体外维持造血干祖细胞的干性，后续，在体外维持造血干祖细胞的干性的同时，可以研究如何使造血干祖细胞获得增殖的方法，从而能够在体外获得大量造血干祖细胞，为再生医学的细胞来源问题提供一种新的途径。

A culture medium and method for maintaining stem cell viability in vitro

The present invention discloses a culture medium and method for maintaining the stem progenitor cell of human hematopoietic progenitor cells in vitro. The medium contains basic medium and maintain small molecule combination, the sustaining small molecule combination is CFO, in which C is CHIR99021, F is Forskolin, O is OAC1. The culture medium of the invention can maintain the stem of hematopoietic stem progenitor cells in vitro, followed by maintaining the stem of hematopoietic stem progenitor cells in vitro, and can study how to make the hematopoietic stem progenitor cells proliferate, so that a large number of hematopoietic progenitor cells can be obtained in vitro, providing a kind of cell source problem for regenerative medicine. The new way.

【技术实现步骤摘要】
一种体外维持人造血干祖细胞干性的培养基及方法
本专利技术属于生物
，特别是涉及一种体外维持人造血干祖细胞干性的培养基及方法。
技术介绍
人造血干祖细胞(HSPC)是所有成体干细胞中研究最为透彻，应用最广泛的干细胞。人造血干祖细胞能不断进行自我更新，和分化成不同的血细胞和免疫细胞，成人骨髓每天可产生大约1万亿的细胞。同种异体的人造血干祖细胞移植是目前治疗大量恶性血液病的唯一治疗方案。人造血干祖细胞的获得可以从健康人粒细胞-集落刺激因子动员的外周血中提取，但数量有限，如何大量获得人造血干祖细胞一直限制着它的应用。体外扩增培养是一个增加细胞数量的办法，但人造血干祖细胞在体外培养时，很容易进行分化，无法保持其作为干细胞的干性，而一旦分化便失去了移植的价值，所以如何在体外培养时，即可以维持人造血干祖细胞的干性，同时又能够使其进行扩增，是两个研究的方向。近年来，利用小分子化合物来控制细胞命运决定成为了研究的热点。小分子化合物作用优势明显，进出细胞更为便捷，浓度和组合方便可控，无免疫原性，也更为经济。2010年，科学家发现苯酚受体拮抗剂(SR1)能够促进人造血干祖细胞的体外扩增；随后的研究进一步揭示RNA连接蛋白(MSI2)削弱苯酚受体的信号通路促进人造血干祖细胞体外扩增的机制；另一方面，SR1诱导扩增的人造血干祖细胞也进入了阶段Ⅰ/Ⅱ的临床测试。2014年，研究者们又发现嘧啶吲哚衍生物(UM171)能够独立于苯酚受体的信号通路，促进人造血干祖细胞的体外增殖。CHIR99021能通过激活WNT信号通路在体外刺激人造血干祖细胞的扩增，但同时也激活mTOR信号，研究者就通过组合CHIR99021和mTOR抑制剂Rapamycin从而达到小分子化合物作用互补的效果，实现人造血干祖细胞体外的有效增殖。PGE2是一种脂质信号分子，能调节造血系统的功能，也有利于人造血干祖细胞的体外增殖与移植归巢。此外，重编程基因OCT4的激活剂，细胞周期蛋白P18的抑制剂，P38的抑制剂，以及能够模拟细胞低氧环境的小分子化合物，皆能促进人造血干祖细胞的体外扩增。综上所述，大量筛选实验已经找到具有增殖人造血干能力的单个小分子，小分子组合的尝试严重缺乏。事实证明，利用小分子组合来控制细胞命运，潜力巨大。北大邓宏魁团队利用小分子化合物组合替代了所有的外援基因表达，并成功将小鼠成纤维细胞重编成为多能干细胞。这一突破性的进展打开了细胞命运控制的黑匣子。利用极为相似的小分子化合物组合，人们先后实现了成纤维向神经和心肌、小肠上皮向内胚层的转分化。有趣的是，类似的小分子组合，能同时诱导生成来自三个胚层的不同祖细胞，更能建立小鼠肝脏前体细胞的功能性培养条件。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的不足，提供了一种体外维持人造血干祖细胞干性的培养基及方法，本专利技术通过研究筛选获得了一种小分子组合，加入培养基中用于培养人造血干祖细胞，能够很好地维持人造血干祖细胞干性。在系统分析了186种小分子对造血干祖细胞体外维持其干性的基础上，发现了其中有些小分子具有较好的效果，将这些有效的小分子称为维持小分子。一种体外维持造血干祖细胞干性的培养基，包含基础培养基和维持小分子组合，所述维持小分子组合为CFO，其中C为CHIR99021、F为Forskolin、O为OAC1。所述维持小分子组合中各小分子的使用浓度为：C5～20μM，F10～40μM，O2.5～10μM。所述维持小分子组合中各小分子的使用浓度为：C10μM，F20μM，O5μM。诱导小分子组合中，各组分的浓度是在参考各种文献报道的基础上，再经实验验证得到的较为合适的浓度。所述基础培养基包括IMDM和血清替代物。本专利技术还提供了一种非疾病治疗为目的的体外维持造血干祖细胞的方法，使用所述的培养基对造血干祖细胞进行体外培养。所述造血干祖细胞来源于人或其他哺乳动物。所述造血干祖细胞来源于健康人粒细胞-集落刺激因子动员的外周血。体外培养时间为6～8天。本专利技术维持培养基能够在体外维持造血干祖细胞的干性，体外培养后的造血干祖细胞具有未培养的造血干祖细胞特异性分子标签，并且可通过体外克隆形成实验和流式分析以及小鼠体内移植实验来验证培养后造血干祖细胞的干性，单细胞转录组分析也揭露了小分子化合物组合维持造血干祖细胞的分子机制。后续，在体外维持造血干祖细胞的干性的同时，可以研究如何使造血干祖细胞获得增殖的方法，从而能够在体外获得大量造血干祖细胞，为再生医学的细胞来源问题提供一种新的途径。附图说明图1为维持小分子化合物组合筛选的实验设计流程图。图2为186个单独小分子化合物与人造血干祖细胞体外培养7天后，获得的人造血干祖细胞的ACTB和CD34相对表达量的散点图。图3为小分子化合物与人造血干祖细胞体外培养后的细胞形态图，其中图A为对照，图B为只加小分子C，图C为只加小分子F，图D为只加小分子O，图F为加小分子组合CFO。图4为小分子化合物与人造血干祖细胞体外培养后的细胞数目统计图。图5为3个小分子化合物CFO与人造血干祖细胞体外培养获得的人造血干祖细胞CD34相对表达量统计结果图。图6为3个小分子化合物的最佳浓度调整结果图。图7为3个小分子化合物CFO单独处理，两两组合，以及3个小分子化合物组合与人造血干祖细胞体外培养7天后的体外克隆形成统计图。图8为3个小分子化合物CFO单独处理，两两组合，以及3个小分子化合物组合与人造血干祖细胞体外培养7天后的表面蛋白CD34表达的流式分析图。图9为3个小分子化合物CFO组合与人造血干祖细胞体外培养7天后CD34表达的细胞比例比较结果图。图10为小分子化合物组合CFO与人造血干祖细胞体外培养7天后，随机挑取的96个单个人造血干祖细胞的造血相关基因表达热图。图11为小分子化合物组合CFO，以及造血生长因子(HGF)与人造血干祖细胞体外培养7天后移植入免疫缺陷小鼠(NSG)后，流式分析检测人血细胞的重构比例结果图。图12为小分子化合物组合CFO，以及造血生长因子(HGF)与人造血干祖细胞体外培养7天后移植入免疫缺陷小鼠(NSG)后，流式分析检测人血细胞的重构比例统计结果图。图13为未培养的人造血干祖细胞，小分子化合物组合CFO，以及造血生长因子(HGF)与人造血干祖细胞体外培养7天后的单细胞t-SNE分析图，其中A为未培养组，B为对照组，C为CFO组，D为HGF组，E为CFO+HGF组。图14为未培养的人造血干祖细胞，小分子化合物组合CFO，以及造血生长因子(HGF)与人造血干祖细胞体外培养7天后的各个亚群的相关造血基因表达。具体实施方式基础培养基：IMDM(Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium)、20％血清替代物(BIT9500SerumSubstitute，购自StemcellTechnologies公司，货号#09500，为添加有BSA(牛血清白蛋白)、胰岛素(insulin)和转铁蛋白(transferrin(BIT)的IMDM))、100μg/mL链霉素和100U/mL青霉素。维持培养基：为在基础培养基的基础上添加186个小分子化合物，具体索引见表1，2个造血生长因子为100ng/mL干细胞因子(SCF)和50ng/mL血小板生成素(TPO)。实施例1人造血本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外维持造血干祖细胞干性的培养基，包含基础培养基和维持小分子组合，其特征在于，所述维持小分子组合为CFO，其中C为CHIR99021、F为Forskolin、O为OAC1。

【技术特征摘要】
1.一种体外维持造血干祖细胞干性的培养基，包含基础培养基和维持小分子组合，其特征在于，所述维持小分子组合为CFO，其中C为CHIR99021、F为Forskolin、O为OAC1。2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述维持小分子组合中各小分子的使用浓度为：C5～20μM，F10～40μM，O2.5～10μM。3.如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述维持小分子组合中各小分子的使用浓度为：C10μM，F20μM，O5μM。4.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭国骥，姜蒙蒙，张庭月，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33