一种通过果胶酶解得到的新型抗肿瘤化合物制造技术

本发明专利技术提供了一种新型抗肿瘤化合物，以黑灵芝为原料，经过提取、精制分离、果胶酶解得到产物PSG‑果，能够刺激巨噬细胞，明显增强巨噬细胞的吞噬能力和细胞上清中TNF‑α的蛋白表达量，使机体的免疫功能加强，进而增强抵抗疾病的能力。对DPPH自由基的清除效果较好，具有较强的还原能力，可用于抗肿瘤。

A new antitumor compound obtained by pectinase hydrolysis

The invention provides a new type of antitumor compound, using Ganoderma lucidum as raw material, through extraction, purification and separation, and pectinase hydrolysis of PSG fruit, which can stimulate macrophage, enhance macrophage phagocytosis and TNF protein expression in cell supernatant, strengthen the immune function of the body, and then enhance the immune function of the body, and then enhance the immune function of the body and then enhance the immune function of the body and then enhance the immune function of the body. The ability to resist disease. The scavenging effect of DPPH free radical is good, and has strong reducing ability. It can be used for anti-tumor.

【技术实现步骤摘要】
一种通过果胶酶解得到的新型抗肿瘤化合物
本专利技术涉及一种新型抗肿瘤化合物，尤其涉及一种通过果胶酶解得到的新型抗肿瘤化合物。
技术介绍
近年来随着人们生活方式的改变和医疗技术的提高，肿瘤检出人数也呈增高趋势，肿瘤已成为对人类健康造成严重威胁的重要疾病之一，由于对患者机体具有较高的损害性和较高的病死率，抗肿瘤药物的应用和研究一直是人们所关注的焦点，新的治疗理论和新型药物不断被开发和应用。科学家们合成了许多分子靶标明确的抗肿瘤分子药物，但是由于化学合成药物的开发周期长以及研发费用昂贵，且临床毒副作用大，制约了药物的进一步研发和应用。中草药和植物药等天然药用材料中存在着广泛的生物活性物质，研究者可从中药中寻找毒副作用小、药理作用独特的抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型抗肿瘤药物，对免疫巨噬细胞则有明显的激活作用，通过刺激机体的免疫功能来消灭肿瘤细胞，而不是通过细胞毒作用直接抗肿瘤。本专利技术的技术方案如下：一种通过果胶酶解得到的新型抗肿瘤化合物，制备方法为：(1)取干燥黑灵芝药材100g，加95％乙醇室温浸泡提取48h，过滤，重复一次，药渣于室温下置通风处晾干，然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1：20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间依次为2h，1h，合并提取液，离心分离，减压浓缩；所得样品加入适量的95％乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80％，然后进行沉淀，4℃下静置24h，离心过滤；沉淀物合并，依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物，冷冻干燥得样品；取得到的干燥样品，以Sevag法除蛋白，即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇＝5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀，静置，除去下层蛋白质变性层；将样品浓缩，重复除蛋白操作10次；浓缩除蛋白样品后用95％乙醇洗涤，再浓缩，冻干得粗提物样品；将粗提物样品使用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得黑灵芝精提物；(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg，加入蒸馏水配成浓度为3～5mg/mL的溶液，离心，上清液过凝胶柱层析，使用的层析系统是Purifier100生物大分子纯化系统，凝胶柱Hiload26/60Superdex-200prepgrade，上样前将样品和洗脱液过0.22μm微孔滤膜以保护分离柱，洗脱液为蒸馏水，流速为2mL/min，上样体积为5mL，分部收集体积为8mL/管，紫外检测器和示差折光检测器检测(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况；取第6-14管合并，浓缩，冷冻干燥得到黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色的絮状固体；(3)取PSG100mg，加30mL100mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)，用50μL果胶酶进行酶解，加盖，于37℃下保温24h，经中和后迅速升温至60℃灭酶5min，抽滤得酶解产物，并通过SephadexG-50凝胶柱色谱分离，获得酶解主产物PSG-果。所述果胶酶为生化试剂，由Sigma公司生产。本专利技术得到的果胶酶解产物PSG-果能够刺激巨噬细胞，明显增强巨噬细胞的吞噬能力和细胞上清中TNF-α的蛋白表达量，使机体的免疫功能加强，进而增强抵抗疾病的能力。对DPPH自由基的清除效果较好，具有较强的还原能力，可用于抗肿瘤。附图说明图1为PSG-果的高效凝胶渗透色谱图。图2为PSG-果和PSG的红外光谱图。图3为PSG-果清除DPPH自由基的能力示意图。图4为硫酸亚铁标准曲线图。具体实施例实施例1：一种通过果胶酶解得到的新型抗肿瘤化合物，制备方法为：(1)取干燥黑灵芝药材100g，加95％乙醇室温浸泡提取48h，过滤，重复一次，药渣于室温下置通风处晾干，然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1：20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间依次为2h，1h，合并提取液，离心分离，减压浓缩；所得样品加入适量的95％乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80％，然后进行沉淀，4℃下静置24h，离心过滤；沉淀物合并，依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物，冷冻干燥得样品；取得到的干燥样品，以Sevag法除蛋白，即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇＝5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀，静置，除去下层蛋白质变性层；将样品浓缩，重复除蛋白操作10次；浓缩除蛋白样品后用95％乙醇洗涤，再浓缩，冻干得粗提物样品；将粗提物样品使用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得黑灵芝精提物；(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg，加入蒸馏水配成浓度为3～5mg/mL的溶液，离心，上清液过凝胶柱层析，使用的层析系统是Purifier100生物大分子纯化系统，凝胶柱Hiload26/60Superdex-200prepgrade，上样前将样品和洗脱液过0.22μm微孔滤膜以保护分离柱，洗脱液为蒸馏水，流速为2mL/min，上样体积为5mL，分部收集体积为8mL/管，紫外检测器和示差折光检测器检测(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况；取第6-14管合并，浓缩，冷冻干燥得到黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色的絮状固体；(3)取PSG100mg，加30mL100mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)，用50μL果胶酶进行酶解，加盖，于37℃下保温24h，经中和后迅速升温至60℃灭酶5min，抽滤得酶解产物，并通过SephadexG-50凝胶柱色谱分离，获得酶解主产物PSG-果。一、产物的理化性质对实施例1制得PSG-果进行红外光谱分析，同时测定纯度、平均分子量、糖醛酸含量。(1)纯度鉴定用高效渗透凝胶色谱法进行纯度的检测，取测试样品3mg溶于1mL蒸馏水，1000rpm离心10min，用微孔过滤膜过滤后自动上样20μL，记录洗脱曲线用于判定该组分的纯度。实验所用的HPLC的具体测试条件如下：色谱柱为UltrahydrogelTM500300mm×7.8mmid；流动相为0.1MNaCl；流速0.6mL/min；柱温35℃。(2)分子量测定液相色谱柱为UltrahydrogelTM500300mm×7.8mmid，流动相为0.1MNaCl，流速为0.6mL/min，柱温为35℃。配制各标准品Glc，T10，T40，T70，T500，T20002％溶液，各溶液在HPLC进样后得到相应的液相图谱。设定T2000的洗脱体积为柱的空体积V0，Glc的洗脱体积作为柱的总体积Vt，以公式Kav＝(Ve-V0)/(Vt-V0)计算，以LogMw-Kav作图得标准曲线。根据样品的Ve，从标准曲线上即得样品的分子量。由于洗脱液的流速恒定，所以可以绘制出保留时间与分子量关系的标准曲线，根据其回归方程即可求得各产物的分子量。(3)糖醛酸含量测定a、采用改良的硫酸咔唑法，以半乳糖醛酸为标准测定糖醛酸的含量。b、高效液相色谱法色谱条件色谱柱：Sugar-PakⅠ(300mm×6.5mm)，流动相：0.0001mol/LEDTA水溶液，流速：0.6mL/min，示差检测器，柱温：90℃，示差检测池温度：40℃，进样量：20μL。标准曲线的绘制精密称取半乳糖醛酸对照品适量，加超纯水溶解，摇匀，制得0.16432，0.32864，0.49296，0.65728，0.8216，0.98592，1.15024，1.31456，1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过果胶酶解得到的新型抗肿瘤化合物，其特征在于：制备方法为：(1)取干燥黑灵芝药材100g，加95％乙醇室温浸泡提取48h，过滤，重复一次，药渣于室温下置通风处晾干，然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1：20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间依次为2h，1h，合并提取液，离心分离，减压浓缩；所得样品加入适量的95％乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80％，然后进行沉淀，4℃下静置24h，离心过滤；沉淀物合并，依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物，冷冻干燥得样品；取得到的干燥样品，以Sevag法除蛋白，即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇＝5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀，静置，除去下层蛋白质变性层；将样品浓缩，重复除蛋白操作10次；浓缩除蛋白样品后用95％乙醇洗涤，再浓缩，冻干得粗提物样品；将粗提物样品使用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得黑灵芝精提物；(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg，加入蒸馏水配成浓度为3～5mg/mL的溶液，离心，上清液过凝胶柱层析，使用的层析系统是

【技术特征摘要】
1.一种通过果胶酶解得到的新型抗肿瘤化合物，其特征在于：制备方法为：(1)取干燥黑灵芝药材100g，加95％乙醇室温浸泡提取48h，过滤，重复一次，药渣于室温下置通风处晾干，然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1：20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间依次为2h，1h，合并提取液，离心分离，减压浓缩；所得样品加入适量的95％乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80％，然后进行沉淀，4℃下静置24h，离心过滤；沉淀物合并，依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物，冷冻干燥得样品；取得到的干燥样品，以Sevag法除蛋白，即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇＝5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀，静置，除去下层蛋白质变性层；将样品浓缩，重复除蛋白操作10次；浓缩除蛋白样品后用95％乙醇洗涤，再浓缩，冻干得粗提物样品；将粗提物样品使用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得黑灵...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈奕，聂少平，谢明勇，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西,36