一种安丝菌素P-3的提取与分离纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种提取与分离纯化方法，具体采用溶剂萃取并结合柱层层析的方法进行分离纯化，本发明专利技术的技术方案具有在进行柱层析前便可去除一部分杂质并能够减小后续分离纯化难度的优点，且可适用于美登素类化合物的分离纯化。与现有技术相比，本发明专利技术的技术方案提取效率高，分离效果好，方便易行，可操作性好，并且不需要色谱柱进行分离，溶剂还可回收利用，降低了生产成本，适合工业化生产应用；通过高效液相检测，本发明专利技术制备的安丝菌素P‑3纯度高，含量可达80％以上。

Extraction and separation and purification of an P-3

The invention provides a method for extraction and separation and purification, and is specifically separated and purified by solvent extraction and column layer chromatography. The invention has the advantages of removing some impurities before column chromatography and can reduce the difficulty of subsequent separation and purification, and can be applied to the compounds of the meenenes. Separation and purification. Compared with the existing technology, the technical scheme of the invention has high extraction efficiency, good separation effect, easy operation, good operability, no need for separation of chromatographic columns, solvent recovery and utilization, reduced production cost and suitable for industrial production applications. By high performance liquid phase detection, the invention is prepared by the invention of P 3 The purity is high, and the content can be over 80%.

【技术实现步骤摘要】
一种安丝菌素P-3的提取与分离纯化方法
本专利技术属于生物制药领域，涉及美登素类化合物的分离纯化，特别涉及一种从液体发酵培养液或固体发酵培养基中提取及分离纯化安丝菌素P-3的方法。
技术介绍
抗生素在为人类控制传染病、肿瘤化疗以及农牧业生产方面做出了卓越的贡献。安丝菌素(Ansamitocin)便是一种美登素类(Maytansinoid)抗生素，主要是从微生物比如橙色珍贵束丝放线菌(ActinosynnemapretiosumATCC31565)发酵生产或高等植物中分离获得，且具有较强的真核细胞毒性及抗肿瘤活性。美登素类化合物抗肿瘤机制与秋水仙碱和长春新碱相似均可阻止细胞的有丝分裂，但其与微管蛋白结合位点上的结合强度约为长春新碱的100倍。安丝菌素本身具有抑制微管蛋白聚集和降解聚集后的微管的功能，因此细胞经过安丝菌素P-3处理后便会停留在有丝分裂中期并出现一系列细胞水平的变化，从而达到抗肿瘤的效果。安丝菌素化学结构式为：安丝菌素是Higsahide等人在1977年从诺卡氏菌C-15003的发酵液中分离出的一种新的有潜在抗癌活性的安莎霉素，其母核是19-C的大环内酰胺环，按C-3连接不同长度的碳链，可分为AP-0(美登醇)、AP-1、AP-2、AP-3、AP-3’和AP-4，其中，连接异丁基的安丝菌素P-3(AP-3)的活性最强，在所有发酵产生的安丝菌素中产量也较高，所以AP-3常作为发酵的目标产物。由于安丝菌素类化合物的生理活性非常强，在哥本哈根举行的第二届世界卫生组织(WHO)专家会议中，安莎类化合物被分为第一类关键重要性人用抗生素药物。且作为高效低毒的新型靶向药物，安丝菌素在新型抗肿瘤药物抗体偶联物研究中备受关注。目前，安丝菌素的制备方法主要有微生物发酵法、化学合成、生物合成、前体诱导法、半合成等，由于安丝菌素特有的大环内酯结构，合成难度较高。微生物发酵生产安丝菌素便成为常用的方法，但安丝菌素发酵水平低下，且分离纯化繁琐、效率低下、市场价格昂贵，严重限制了对其进一步的药理研究及应用。其微生物发酵的发酵工艺已有多篇专利报道，但其分离纯化主要集中在高效逆流色谱技术，但发酵产物成分复杂，使得其柱效不高,分离的组分不够多的缺点尤为突出。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从液体发酵培养液或固体发酵培养基中提取及分离纯化安丝菌素P-3的方法。其提取效率高，分离效果好，方便易行，可操作性好，同时避免了复杂设备(HPLC制备柱)的使用，可实现安丝菌素P-3快速纯化的目的。实现本专利技术目的所采用的技术方案是：一种安丝菌素P-3的提取与分离纯化方法，该方法包括以下步骤：1)将发酵结束的发酵液或固体发酵培养基用萃取溶剂进行萃取，得到萃取液；2)将步骤1)得到的萃取液集中浓缩至无萃取溶剂流出得到浓缩浸膏粗品A，然后加入中性氧化铝，并用有机溶剂使其与粗品A混合均匀；3)将步骤2)混合均匀的粗品A旋蒸至干燥的沙状；4)将有机溶剂加入到步骤3)干燥的沙状粗品A中，震荡静置，取上清液；5)将步骤4)的上清液集中浓缩，加入硅胶旋蒸至沙状，用柱层析法梯度洗脱得到安丝菌素P-3。其中，步骤1)中所述的萃取溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈或乙酸丁酯，加入量与发酵液或培养基等体积，其中，固体琼脂培养基切割成1-3cm的小块，优选浸泡震荡5-15min，重复萃取3次。步骤2)中所述的加入中性氧化铝的量是浓缩浸膏的质量的1.2-1.5倍，优选加入的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、乙酸丁酯中的任意一种或几种的混合，直至中性氧化铝与浓缩浸膏混合均匀，更优选加入有机溶剂直到浓缩浸膏完全溶解。步骤2)3)5)中所述的浓缩及旋蒸优选为减压旋转蒸发方式，旋转蒸发过程中的水浴温度为35-45℃。步骤4)中所述的有机溶剂为乙酸乙酯、甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸丁酯中的任意一种或几种的混合，优选所述溶剂的用量为每克沙状粗品A使用5-20mL，震荡2-5min，静置5-10min，取上清液，重复5-10次。步骤5)中所述的上清液集中浓缩至能完全浸没加入的硅胶，优选加入硅胶的量是浓缩粗品A的质量的1.2-1.5倍，柱层析的固定相可用硅胶(200-300目)、中性氧化铝(200-300目)或D-101型大孔吸附树脂(60-16目)来填充，层析柱直径大小及固定相的用量是本领域普通技术人员通过样品的量及纯度可以确定的，本专利技术中选用的固定相的量是粗品A与硅胶质量和的5-10倍。优选步骤5)的具体操作为，将固定相湿法装柱并用石油醚压柱，优选用加压压柱，将柱子压实后加入旋至沙状的硅胶样品(干法上样)，加入少量石油醚，再将一团脱脂棉塞至接近固定相表面，加入一些洗脱剂，梯度洗脱，薄层层析法(TLC)追踪筛选。本专利技术优选的洗脱剂为石油醚(PE)和乙酸乙酯(EA)，按照PE—EA体积比10:1,5:1,3:1,2:1,1:1,1:2进行梯度洗脱。跟踪优选所述TLC检测所用的展开剂为甲醇：乙酸乙酯：石油醚(体积比)＝0.1：2：1，TLC检测收集含有安丝菌素P-3的洗脱液并集中旋蒸。上述方法中，优选进一步还包括步骤6)：向步骤5)得到的安丝菌素P-3浓缩物中加入适量正己烷然后超声浓缩物至有白色混浊物出现，然后低温静置重结晶；或加入少量乙酸乙酯溶解浓缩物，再加入大量石油醚低温静置重结晶。优选温度4℃，静置5～18h去除溶剂留下重结晶物。为达到特定纯度或追求更高纯度，可选择将上述方法中的步骤6)重复操作一次或多次。本专利技术中步骤2)、3)、4)对步骤5)的柱层析有很大的影响，可大大降低分离难度，同时，由于中性氧化铝具有吸附作用，能够吸附部分发酵产物中提取出来的混合物，在柱层析前能够去除比安丝菌素P-3极性大的一些化合物及色素，从而减小了粗品的质量，一方面减少了后续用于分离纯化的粗产物的质量，另一方面还减小了后续的分离难度，使得安丝菌素P-3的分离纯化更容易顺利实现，并提高了其分离的纯度。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的技术方案提取效率高，分离效果好，方便易行，可操作性好，且不需要色谱柱(HPLC制备柱)进行分离，溶剂还可回收利用，降低了生产成本，适合工业化生产应用；通过高效液相检测，本专利技术制备的安丝菌素P-3纯度高，含量可达80％以上(未重结晶)。附图说明图1为对比实施例1中安丝菌素P-3分离的纯品HPLC图；图2为实施例2中安丝菌素P-3浓缩浸膏与粗品及分离的纯品的TLC图；图3为实施例2中安丝菌素P-3分离的纯品HPLC图；图4为实施例3中安丝菌素P-3分离的纯品HPLC图；图5为实施例3中安丝菌素P-3分离的纯品质谱图；图6为实施例3中安丝菌素P-3分离的纯品1H-NMR图；具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明，应理解，这些实施例仅用于解释说明的目的，而不意味着限制本专利技术的范围和实质。本专利技术中采用高效液相色谱法(HPLC)分析测定安丝菌素P-3，色谱条件为EclipseXDB-C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-水(70：30)；流速为0.8mL/min；检测波长为254nm；柱温为25℃；进样量为20μl。对比实施例1一种从液体发酵培养液提取及分离纯化安丝菌素P-3的方法，其包括如下步骤：1)安丝菌素P-3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种安丝菌素P‑3的提取与分离纯化方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1)将发酵结束的发酵液或固体发酵培养基用萃取溶剂进行萃取，得到萃取液；2)将步骤1)得到的萃取液集中浓缩至无萃取溶剂流出得到浓缩浸膏粗品A，然后加入中性氧化铝，并加入有机溶剂使其与粗品A混合均匀；3)将步骤2)混合均匀的粗品A旋蒸至干燥的沙状；4)将有机溶剂加入步骤3)干燥的沙状粗品A中，震荡静置，取上清液；5)将步骤4)的上清液集中浓缩，加入硅胶旋蒸至沙状，用柱层析法梯度洗脱得到安丝菌素P‑3。

【技术特征摘要】
1.一种安丝菌素P-3的提取与分离纯化方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1)将发酵结束的发酵液或固体发酵培养基用萃取溶剂进行萃取，得到萃取液；2)将步骤1)得到的萃取液集中浓缩至无萃取溶剂流出得到浓缩浸膏粗品A，然后加入中性氧化铝，并加入有机溶剂使其与粗品A混合均匀；3)将步骤2)混合均匀的粗品A旋蒸至干燥的沙状；4)将有机溶剂加入步骤3)干燥的沙状粗品A中，震荡静置，取上清液；5)将步骤4)的上清液集中浓缩，加入硅胶旋蒸至沙状，用柱层析法梯度洗脱得到安丝菌素P-3。2.根据权利要求1所述的安丝菌素P-3的提取与分离纯化方法，其特征在于：步骤1)中所述的萃取溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈或乙酸丁酯中的一种。3.根据权利要求1所述的安丝菌素P-3的提取与分离纯化方法，其特征在于：步骤2)中所述的中性氧化铝的加入量为浓缩浸膏质量的1.2-1.5倍，加入的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、乙酸丁酯中的一种或几种的混合物。4.根据权利要求1所述的安丝菌素P-3的提取与分离纯化方法，其特征在于：步骤2...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡志强，周少敏，朱孝霖，郭静，杨广花，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32