基于血清标志物MMP-7的胆道闭锁诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种基于血清标志物MMP‑7的胆道闭锁诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括抗人MMP‑7单克隆抗体包被的酶标板、阴性对照液、阳性对照液、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液；与现有技术相比，本发明专利技术提供了一种新的灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，定量测定人血清中MMP‑7的水平，有助于早期诊断BA；提供的血清生物标志物蛋白质MMP‑7诊断BA的敏感性为100％，特异性为95.6％，具有高特异性和高敏感性的特点；提高BA的早期诊断率，减少误诊，提高BA自身肝脏生存率。

Diagnostic kit for biliary atresia based on serum marker MMP-7

The present invention relates to a diagnostic kit for biliary atresia based on the serum marker MMP 7. The diagnostic kit includes an enzyme labeled plate, a negative control liquid, a positive control solution, an enzyme reagent, an enzyme substrate solution, a sealing solution, a sample dilution liquid, a detergent solution and a terminating solution. In comparison, the invention provides a new sensitive, safe, reliable and easy to operate commercial reagent kit for quantitative determination of the level of MMP 7 in human serum, which is helpful for early diagnosis of BA, and the sensitivity of the serum biomarker protein MMP 7 diagnostic BA is 100%, the specificity is 95.6%, with high specificity and Gao Min sensibility. To improve the early diagnosis rate of BA, reduce misdiagnosis and improve the BA liver survival rate.

【技术实现步骤摘要】
基于血清标志物MMP-7的胆道闭锁诊断试剂盒
本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及一种基于血清标志物MMP-7的胆道闭锁诊断试剂盒。
技术介绍
胆道闭锁(Biliaryatresia，BA)是以肝外胆管进行性炎症、快速肝纤维化为特征的新生儿胆汁淤积性疾病，疾病进展迅速，3月以内行Kasai手术(肝门空肠吻合术)效果较好。该疾病在西方国家的发生率为1/17000-1/19000，而在台湾地区、日本为1/7000-1/13000，大陆地区的发生率为1/5000-1/12000[1-6]，是小儿肝移植最常见病因[2,7,8]。现有的BA筛查和诊断血清学指标包括：①血清总胆红素，直接胆红素；其作为最初筛查指标。新生儿血清总胆红素>2.0mg/dL(42–51μmol/L)，或直接胆红素>1.0mg/dL(17μmol/L)需进行BA排查，但对于诊断BA特异性差；②GGT：大样本调查研究表明，不同年龄组中，BA组GGT含量均明显高于其他胆汁淤积疾病组[9]。Liu等人[10]报道GGT>300U/L时，其诊断BA的精确度为60％-85％诊断。GGT是胆道闭锁最常用的筛查指标，但临床病例中不同患儿之间差异较大，准确性受到局限；③其他指标：血清胆酸、凝血酶原浓度、血小板测定影响因素较多。影像学检查中，异常胆囊(胆囊缩小，收缩差)和肝门部纤维块是超声检查胆道闭锁患儿肝脏的特征性表现[11,12]，但肝门部纤维块不一定在每个患儿中均出现，并且超声检查因不同医生、机器等观察结果差异较大。因此文献中报道诊断BA的敏感性与特异性各不相同[10,13-19]。近期，有Meta分析报道，胆囊闭锁和肝门部纤维块的特异性均可达到99％，然而相对应的敏感性为28％和80％[10]。其它检查虽然可以给胆道闭锁的诊断提供一些线索，但受到不同程度的限制。如十二指肠肠液检测操作困难；放射性核素检查可不同程度加重患儿梗阻性黄疸[2,20]；3个月龄以内的婴儿胆管直径小、胆管内液体少[21]，磁共振胰胆管成像检查诊断胆道闭锁的高假阳性率不可避免。此外，BA的病理特征为小胆管增生、胆栓形成、毛细胆管和肝细胞胆汁淤积、汇管区或小叶周围纤维化，早期尚可见肝小叶结构[1,20,21]。而α1抗胰蛋白酶缺乏疾病的病理表现与之重叠，偶尔Alagille综合症、囊性纤维化、全胃肠外营养相关的胆汁淤积也可表现为相似的病理改变[1]。因此，临床应用于鉴别BA与其他新生儿胆汁淤积症时，因检测准确性低或过程复杂导致BA诊断和治疗的延迟。疾病早期，BA的临床表现、生物化学指标、影像学和组织学特征与其它胆汁淤积疾病存在重叠性，鉴别诊断过程曲折、复杂，容易导致诊断延迟。因此探索简单、特异性诊断方法从未停止。以往研究显示基质金属蛋白酶7(Matrixmetalloproteinases-7，MMP-7)在慢性肝脏疾病中与肝纤维化形成有关[22]。最近发现MMP-7可激活BA胆管上皮先天性免疫反应并参与胆管的炎性损伤[23-25]。本项目通过病例对照研究MMP-7在BA患儿血清和肝内胆管组织中的表达情况，证明血清MMP-7水平在胆道闭锁诊断中具有应用价值。参考文献[1]SokolRJ,MackC,NarkewiczMR,等。胆道闭锁发病机制和预后的最新观念。儿科胃肠病学与营养学,2003,37(1):4-21.[2]HartleyJL,DavenportM,KellyDA。胆道闭锁。柳叶刀,2009,374(9702):1704-1713.[3]Sanchez-ValleA,KassiraN,VarelaVC等。胆道闭锁：流行病学、遗传学、临床进展及公共卫生。儿科前沿,2017,64(1):285-305.[4]SongZ,DongR,ShenZ等。对行Kasai手术时年龄小于60天的不同病因胆道闭锁婴儿预后的回顾性研究。医学(巴尔的摩)，2017,96(26):e7267.[5]OhiR。从手术角度看胆道闭锁。临床肝病学,2000,4(4):779-804.[6]HopkinsPC,YazigiN,NylundCM。美国胆道闭锁的发病率及肝门空肠吻合术的手术时机。儿科学杂志，2017,187:253-257.[7]deCarvalhoE,IvantesCA,BezerraJA。肝外胆道闭锁的最新观念及未来方向。儿科学(里约)，2007,83(2):105-120.[8]SokolRJ,ShepherdRW,SuperinaR等。胆道闭锁筛查及预后的概况—来自美国国立卫生研究院。肝脏病学,2007,46(2):566-581.[9]ChenX,DongR,ShenZ等。γ-GT与年龄结合诊断胆道闭锁的价值。儿科胃肠病学与营养学，2016,63(3):370-373.[10]LiuCS,ChinTW,WeiCF。γ-GT对早期诊断胆道闭锁的价值。中华医学杂志(台北)，1998,61(12):716-720.[11]TanKendrickAP,PhuaKB,OoiBC等。利用肝门纤维块及胆囊长度诊断胆道闭锁。儿科影像学，2000,30(2):69-73.[12]RamachandranP,SafwanM,ReddyMS等。发展中国家诊断和处理胆道闭锁的最新趋势。印度儿科学，2015,52(10):871-879.[13]TiaoMM,ChuangJH,HuangLT等。胆道闭锁的处理：来自一个单中心的经验。长庚医学杂志，2007,30(2):122-127.[14]KimWS,CheonJE,YounBJ等。胆道闭锁的超声协助诊断：超声下肝动脉直径。影像学杂志，2007,245(2):549-555.[15]ParkWH,ChoiSO,LeeHJ等。超声下肝门纤维块结合胆囊影像对胆道闭锁与婴儿胆汁淤积的鉴别诊断。小儿外科杂志，1999,34(11):1706-1710.[16]NematiM,RafeeyM,ShakeriAB.胆道闭锁超声征象：三角条索征。巴基斯坦生物科学杂志，2009,12(1):95-97.[17]ZhouL,ShanQ,TianW,etal.等。超声诊断胆道闭锁的Meta分析。美国放射学杂志，2016,206(5):W73-82.[18]El-GuindiMA,SiraMM,KonsowaHA等。多普勒超声检查肝包膜下血流诊断胆道闭锁的价值。小儿实用外科学杂志，2013,28(5):867-872.[19]SilesP,AscheroA,GorincourG等。3月以下儿童的胆道系统结构是否能通过磁共振胰胆管造影直观表现的前瞻性研究。儿科放射学杂志,2014,44(9):1077-1084.[20]El-GuindiMA,SiraMM,SiraAM等。设计与验证一个胆道闭锁诊断评分系统。小儿肝病学杂志，2014,61(1):116-123.[21]FawazR,BaumannU,EkongU等。婴幼儿胆汁淤积性黄疸评估指南：建议来自北美小儿胃肠营养学会和欧洲小儿胃肠营养学会。胃肠营养与儿科学杂志，2017:64(1):154-168.[22]HungTM,ChangSC,YuWH等。一种新的、拥有多种功本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于血清标志物MMP‑7的胆道闭锁诊断试剂盒，该诊断试剂盒包括抗人MMP‑7抗体包被的酶标板，阳性对照液，样品稀释液，酶标试剂A、酶标试剂B，酶底物溶液，洗涤液和终止液；所述阳性对照液为含有MMP‑7的稀释于样品稀释液中血清，含MMP‑7浓度为40ng/mL。所述样品稀释液为0.01mol/L pH 7.4PBS；阴性对照液即为样品稀释液。所述酶标试剂A为生物素化的MMP‑7抗体，酶标试剂B为HRP标记的亲和素，浓度为0.1‑111g/mL。所述酶底物溶液为3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液，包括显色剂A和显色剂B，显色剂A为500mL溶液中含有醋酸纳13.6g、柠檬酸1.6g和30％双氧水0.3mL；显色剂B为500mL溶液中含有TMB 350mg、二甲亚砜20mL和柠檬酸.H2O 5.1g。所述洗涤液为0.0lmol/L pH 7.4磷酸盐‑NaCl缓冲液PBST，PBST内含0.05％吐温20，即1升溶液中含8g NaCl、0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4‑12H2O、0.2g KCl和0.5mL Tween‑20。所述终止液为2mol/L H2SO4溶液。...

【技术特征摘要】
1.一种基于血清标志物MMP-7的胆道闭锁诊断试剂盒，该诊断试剂盒包括抗人MMP-7抗体包被的酶标板，阳性对照液，样品稀释液，酶标试剂A、酶标试剂B，酶底物溶液，洗涤液和终止液；所述阳性对照液为含有MMP-7的稀释于样品稀释液中血清，含MMP-7浓度为40ng/mL。所述样品稀释液为0.01mol/LpH7.4PBS；阴性对照液即为样品稀释液。所述酶标试剂A为生物素化的MMP-7抗体，酶标试剂B为HRP标记的亲和素，浓度为0.1-111g/mL。所述酶底物溶液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，包括显色剂A和显色剂B，显色剂A为500mL溶液中含有醋酸纳13.6g、柠檬酸1.6g和30％双氧水0.3mL；显色剂B为50...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤绍涛，阳历，周莹，曹国庆，张茜，许培培，常晓盼，李帅，普佳睿，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42