弓形虫胶体金免疫层析试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种弓形虫病检测胶体金免疫层析试纸条，所述试纸条包括依照样品流动方向依次排列的样品垫、胶体金结合垫、检测线、质控线和吸水材料，其中，检测线中包括弓形虫特异性抗原。本发明专利技术提供的弓形虫胶体金免疫层析试纸条能够简单、方便的对人及多种哺乳类动物弓形虫进行快速检测。

Colloidal gold immunochromatographic strip for Toxoplasma gondii and its preparation method

The invention provides a colloidal gold immunochromatographic test paper for the detection of toxoplasmosis, which includes a sample pad, a colloidal gold binding pad, a detection line, a quality control line and a water absorbent material arranged in accordance with the flow direction of the sample. The detection line includes the specific anti primitive of the Toxoplasma gondii. The colloidal gold immunochromatographic test strip provided by the invention can detect Toxoplasma gondii rapidly in humans and many mammals.

【技术实现步骤摘要】
弓形虫胶体金免疫层析试纸条及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种弓形虫胶体金免疫层析试纸条及其制备方法。
技术介绍
弓形虫是一种分布广泛的，专性细胞内寄生虫，在感染人或动物后可通过胎盘方式垂直传播，造成胎儿畸形，早产，神经系统发育障碍；也可经口传播，如饮用未经灭菌的奶制品，或使用未熟的肉类；对宿主选择性不强，可寄生在多种动物的有核细胞中，并侵害多种组织器官。其中羊是较易感动物，在感染后表现出流产、产死胎和弱畜，给人类和养殖业造成严重威胁。为了寻找敏感、特异、快速的诊断方法，国内外学者在弓形虫病诊断方面进行了大量研究。目前，常见的弓形虫病诊断方法有病原学方法、分子生物学方法、免疫学方法等，但多出现检出率不高，操作繁杂，灵敏度低等缺点，为适应基层大规模普查的需要，有必要研制出针对多种动物的快速检测试剂盒，以便能够简单、方便的对弓形虫进行检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种弓形虫胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，以便能够简单、方便的对弓形虫进行检测。本专利技术提供了一种弓形虫胶体金免疫层析试纸条，所述试纸条包括依照样品流动方向依次排列的样品垫、胶体金结合垫、检测线、质控线和吸水材料，其中，检测线中包括弓形虫特异性抗原。优选地，所述弓形虫特异性抗原为弓形虫膜表面抗原SAG1和SAG2重构抗原表位的融合蛋白。优选地，所述弓形虫特异性抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述检测线中，所述弓形虫特异性抗原的划线量为1μL/cm-3μL/cm；更优选为2μL/cm。优选地，所述质控线包括链球菌蛋白G。优选地，所述链球菌蛋白G的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种制备弓形虫胶体金免疫层析试纸条的方法，所述方法包括步骤：(1)制备弓形虫特异性抗原使用基因工程菌表达制备SEQIDNO.1所示的弓形虫膜表面抗原SAG1和SAG2的融合蛋白rSAG作为弓形虫特异性抗原；(2)制备重组链球菌蛋白G使用基因工程菌表达制备SEQIDNO.2所示的重组链球菌蛋白G(rSPG)；(3)制备胶体金探针向胶体金溶液中逐滴加入步骤(2)制得的rSPG，获得胶体金探针，将制备好的胶体金探针均匀的滴加于金标垫上；(4)胶体金免疫层析试纸条的制备将NC膜贴于底板上，之后用胶体金点样系统进行划线；分别用rSAG和rSPG作为检测线和质控线，划线后烘干；将金标垫、样品垫、吸水纸依次贴于含有NC膜的底板上。优选地，步骤(1)中，将SEQIDNO.3所示的基因与PET-28a(+)载体连接后，转化至BL21(DE3)感受态细胞，挑取完整单个菌落于含Kana的LB液体培养基中振荡培养，加入1mmol/L的IPTG诱导，使用His亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化，获得弓形虫膜表面抗原SAG1和SAG2的融合蛋白rSAG作为弓形虫特异性抗原。优选地，步骤(3)中，将100mL去离子水和1mL1％氯金酸置于250mL锥形瓶中，加热至沸腾；缓慢加入1.5mL的柠檬酸三钠，观察到溶液颜色由淡黄变黑最后逐渐稳定成紫红色后，继续煮沸15min，冷却至室温后定容到原体积；用0.2％K2CO3调节胶体金溶液pH至5.0；逐滴加入1.2mL1mg/mL的rSPG，振荡15min后静置15min；加入10mL10％PEG20000，使其终浓度为1％，振荡15min后静置15min；2000r/min离心20min，弃沉淀；10000r/min离心30min，弃上清，沉淀用20mLTBS重悬；将制备好的胶体金探针均匀的滴加于金标垫上，使1.0cm2的金标垫中含有100μL的胶体金探针，将金标垫置于-80℃放置2h，真空干燥；优选地，步骤(4)中，将NC膜贴于底板上，之后用胶体金点样系统进行划线；分别用rSAG和rSPG作为检测线(T线)和质控线(C线)，划线后将底板置于37℃烘箱过夜烘干；将金标垫、样品垫、吸水纸依次贴于含有NC膜的底板上，用贴条机以0.3cm的宽度切条。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1为试纸条的结构示意图。图2显示了PET28(a)-SAG蛋白表达结果；M：蛋白标志物；1：无IPTG诱导；2-9：IPTG诱导后1-8h。图3显示了PET28(a)-SAG纯化结果及Westernblot分析；A：M：蛋白标志物；1：纯化前超声破碎后的上清液；2：加样后的流穿液；3：纯化的重组蛋白rSAG；B：M：蛋白标志物；1：重组蛋白与小鼠弓形虫病阳性血清反应条带。图4显示了试纸条与小鼠弓形虫血清样品反应结果；A：重组蛋白含量为2μL/cm的阳性血清反应；B：重组蛋白含量为1μL/cm的阳性血清反应；C：阴性血清反应。具体实施方式本专利技术以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，制备的胶体免疫层析试纸条。本专利技术在原核表达系统中表达出的特异性目的蛋白，具有蛋白产量高、操作简单、费用低廉等优势。本研究对弓形虫抗原基因进行生物学分析，设计并合成弓形虫膜表面抗原SAG1和SAG2多表位重构基因，构建原核表达质粒，对重组的目的蛋白进行表达纯化及抗原性检测，之后进行弓形虫胶体金免疫层析试纸条的制备，为有效防控弓形虫病奠定基础。具体地，为了研制一种可用于检测弓形虫的快速诊断胶体金免疫层析试纸条，本研究对弓形虫表面抗原SAG1和SAG2的基因片段进行重构合成，与PET28a(+)载体连接后，转化至大肠埃希氏杆菌BL21(DE3)中表达，利用His亲和层析柱对融合蛋白进行纯化，获得SAG重组蛋白，Westernblot对重组蛋白免疫原性进行分析。用PET28a(+)-SAG重组蛋白及重组蛋白G分别划线，作为检测线和质控线，制作胶体金免疫层析试纸条，利用小鼠弓形虫阳性血清及小鼠阴性血清检验胶体金免疫层析试纸条检查效果。本研究成功表达纯化了SAG抗原表位的重组蛋白；重组蛋白具有抗原性；以此多抗原表位的重组蛋白作为检查抗原研制了胶体金免疫层析试纸条，能够快速检测弓形虫的阳性血清，为基层弓形虫病的快速诊断奠定了基础。链球菌蛋白G链球菌蛋白G(streptococcalproteinG，SPG)是一种能与人及多种动物IgG结合的链球菌细胞壁蛋白，最早在1973年由Kronvall报道。A、C、G群链球菌的细胞壁及培养上清均含该蛋白，且其特性与葡萄球菌蛋白A(SPA)明显不同。1984年，Bjorck等将这种蛋白统称为链球菌蛋白G，并对其进行了分离纯化。目前，SPA由于具有与抗体Fc端结合的特性，较为广泛的应用于免疫学实验中，而SPG与SPA相比，IgG的结合力更强，结合谱更广。为获得一种能高效结合IgG的工具蛋白，将SPG基因的IgG结合片段进行重构，只保留蛋白与IgG的Fc端特异性结合的C区，用重组蛋白G对胶体金免疫层析试纸条的质控线进行划线。在本专利技术的一个优选地实施例中，重组蛋白G(rSPG)的氨基酸序列如下：TYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEKPEVIDASELTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTEAV本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种弓形虫胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条包括依照样品流动方向依次排列的样品垫、胶体金结合垫、检测线、质控线和吸水材料，其中，检测线中包括弓形虫特异性抗原。

【技术特征摘要】
1.一种弓形虫胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条包括依照样品流动方向依次排列的样品垫、胶体金结合垫、检测线、质控线和吸水材料，其中，检测线中包括弓形虫特异性抗原。2.如权利要求1所述的弓形虫胶体金免疫层析试纸条，其中，所述弓形虫特异性抗原为重构的弓形虫SAG1和SAG2膜表面抗原的融合蛋白。3.如权利要求1所述的弓形虫胶体金免疫层析试纸条，其中，所述弓形虫特异性抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。4.如权利要求1所述的弓形虫胶体金免疫层析试纸条，其中，所述检测线中，所述弓形虫特异性抗原的划线量为1μL/cm-3μL/cm；更优选为2μL/cm。5.如权利要求1所述的弓形虫胶体金免疫层析试纸条，其中，所述质控线包括链球菌蛋白G。6.如权利要求1所述的弓形虫胶体金免疫层析试纸条，其中，所述链球菌蛋白G的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。7.一种制备弓形虫胶体金免疫层析试纸条的方法，其中，所述方法包括步骤：(1)制备弓形虫特异性抗原使用基因工程菌表达制备SEQIDNO.1所示的弓形虫膜表面抗原SAG1和SAG2的融合蛋白的抗原表位rSAG作为弓形虫特异性抗原；(2)制备重组链球菌蛋白G使用基因工程菌表达制备SEQIDNO.2所示的重组链球菌蛋白G(rSPG)；(3)制备胶体金探针向胶体金溶液中逐滴加入步骤(2)制得的rSPG，获得胶体金探针，将制备好的胶体金探针均匀的滴加于金标垫上；(4)胶体金免疫层析试纸条的制备将NC膜贴于底板上，之后用胶体金点样系统进行划线；分别用rSAG和rSPG作为检测线和质控线，划线后烘干；将金标垫、样品垫、吸水...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱传刚，王钊哲，许瑞，林矫矫，陈兆国，洪炀，陆珂，李浩，吴思敏，李嘉静，江嘉欣，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31