本发明专利技术公开了一种同时检测猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的PCR方法，分别以PCV3和PCV2基因组的保守区域设计两对特异性引物，建立了二重PCR检测方法检测方法，以实现对猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型快速准确检测并鉴定的目的。
Establishment of duplex PCR for detection of porcine circovirus type 3 and porcine circovirus type 2
The invention discloses a PCR method for detecting porcine circovirus 3 and porcine circovirus type 2, and designs two pairs of specific primers in the conservative region of PCV3 and PCV2 genome, and a double PCR detection method is established to realize the rapid and accurate detection and identification of porcine circovirus type 3 and porcine circovirus type 2. Yes.
【技术实现步骤摘要】
猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重PCR检测方法的建立
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重PCR检测方法本专利技术涉及检测猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型的引物。
技术介绍
猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)是目前发现的最小的动物病毒，为环状单链DNA病毒，能在哺乳动物细胞中自主复制。PCV包括PCV1和PCV2两个基因型[2]。PCV1是PK15细胞培养过程中发现的病毒，研究认为对猪无致病性。PCV2基因组由1,767-1,768个核苷酸组成，预测有11个开放阅读框(ORF)。基因间隔区(IntergenicRegion，IR)含病毒的复制起点(SL)茎环结构。基因组包含2个主要的ORF，ORF1和ORF2分别编码复制酶(Rep)和衣壳蛋白(Cap)。CapN端143-145aa(NYS)位置存在一个糖基化位点。Rep包含三个潜在的糖基化位点，分别在第23-25aa(NPS)、第256-258aa(NQT)和第286-288aa(NAT)。临床方面，PCV2主要感染家猪和野猪，大多数在4-11周龄时感染。临床常见的PMWS表现包括仔猪消瘦、呼吸困难和淋巴结明显肿大。PDNS特征为红色到紫色的不规则斑块和皮肤丘疹、皮下出血和水肿、以浅表腹股沟为主的淋巴结肿大、双侧肾脏扩大、小皮质瘀斑和肾盂水肿等。PCV3是PCV的一种新基因型，2016年首次报道PCV3与心肌炎和肾小球肾炎有关，研究发现在PDNS症状母猪及其流产胎儿体内检出唯一病原体为PCV3。2017年湖北、广东、安徽等省市陆续检测到PCV3感染猪群的现象。PCV3为单股无囊膜DNA，基因组大小2000bp，包含2个主要开放阅读框(ORF)，其中，ORF1和ORF2分别编码由297个氨基酸组成复制酶蛋白Rep，和214个氨基酸组成衣壳蛋白Cap。PCV2与PCV3Cap蛋白氨基酸同源性仅为30％，同时在研究中发现，二者混合感染率为42.9％。由于PCV3在我国是新发现的疫病，目前尚缺乏针对性的检测技术和方法，无法开展相关病原学和流行病学研究，以科学评估该病对猪群的危害及其程度，并制订出针对性的防控措施。因此，迫切需要发展快速、准确的猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对当前猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型检测技术手段的缺乏，提供一种猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重PCR检测方法及检测用引物。该检测方法的检测灵敏度分别达到可达508copies/μL和412copies/μL，对于单个样本检测时间为1.5个小时，可同时进行大批量的样本检测，具有良好的特异性、敏感性和稳定性，可以实现对猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型快速准确检测并鉴定的目的。在本专利技术的一方面，提供一种猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重PCR检测方法，其特征包括：(1)针对猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型设计能够检测同时检测毒的特异性引物；(2)将用于检测猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的引物置于同一反应管中，使用PCR扩增仪进行PCR反应在本专利技术提供一种用于同时检测猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的引物，其序列为：PCV3F：TTACTTAGAGAACGGACTTGTAACGPCV3R：AAATGAGACACAGAGCTATATTCAGPCV2F：TTTCAGCGATGACGTATCCAAGGAGPCV2R：TAGTATTCAAAGGGCACAGTGAGGG在本专利技术的另一方面，提供检测鸭痘病毒的实时荧光PCR检测的反应程序，具体为：98℃预变性5min，35个循环变性；98℃10s，58℃20s，72℃20s；72℃5min。本专利技术采用PCR进行猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的特异性检测，具有以下优点：(1)特异性好，用该二重PCR反应体系，以PCV3和PCV2阳性模板均能扩增出649bp和295bp的特异性条带，而以其他常见猪病毒核酸为模板时均未扩增出特异性条带；(2)灵敏度高，荧光检测技术是极灵敏的检测技术，本方法的检测灵敏度可达508copies/μL和412copies/μL；(3)操作简便，自动化程度高，扩增和检测短时间完成。附图说明图1为本专利技术实施例1PCV3和PCV2二重PCR退火温度优化结果。1-6：退火温度60℃，59℃，58℃，57℃，56℃。图2为本专利技术实施例2PCV3和PCV2二重PCR检测方法的特异性试验试验结果。1.PCV2；2.PCV3；3.PCV3+PCV2；4～7：分别是PRRSV，JEV，PRV，FMDV；8：阴性对照。图3为本专利技术实施例3PCV3和PCV2的双重PCR检测方法的敏感性试验结果。1：5.08×1010copies/μLPCV3+4.12×1010copies/μLPCV2；2：5.08×109copies/μLPCV3+4.12×109copies/μLPCV2；3：5.08×108copies/μLPCV3+4.12×108copies/μLPCV2；4：5.08×107copies/μLPCV3+4.12×107copies/μLPCV2；5：5.08×106copies/μLPCV3+4.12×106copies/μLPCV2；6：5.08×105copies/μLPCV3+4.12×105copies/μLPCV2；7：5.08×104copies/μLPCV3+4.12×104copies/μLPCV2；8：5.08×103copies/μLPCV3+4.12×103copies/μLPCV2；9：5.08×102copies/μLPCV3+4.12×102copies/μLPCV2；10：阴性对照具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件。实施例1：PCV3和PCV2二重PCR退火温度优化结果1、针对PCV3和PCV2基因设计能够检测PCV3和PCV2的特异性引物：PCV3F：TTACTTAGAGAACGGACTTGTAACGPCV3R：AAATGAGACACAGAGCTATATTCAGPCV2F：TTTCAGCGATGACGTATCCAAGGAGPCV2R：TAGTATTCAAAGGGCACAGTGAGGG上下游引物均由吉林库美生物公司合成。2、提取病毒DNA取PCV3猪组织阳性病料组织样品，加无菌生理盐水研磨成组织悬液，PCV2NM株基因组提取用TakaRaMiniBESTViralDNA/RNAExtractionKit(大连宝生物公司)提取样品DNA。3、PCR检测通过对反应体系及反应条件的优化，最终确定二重PCR体系。每个反应总体积为25μL：1μLDNA，20μL金牌Mix，1μL每种引物(PCV3-F/PCV3-R，PCV2-F/PCV2-R)(10μM)：反应条件为：98℃预变性5min，35个循环变性；98℃10s，58℃20s，72℃20s；72℃5min。4、试验结果1-6：退火温度60℃，59℃，58℃，57℃，56℃。表明实时荧光PCR检测结果与预期相符，表明设计的引物能特异性检本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时检测猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的PCR方法，其特征包括：(1)针对猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型设计能够检测同时检测毒的特异性引物；(2)将用于检测猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的引物置于同一反应管中，使用PCR扩增仪进行PCR反应。
【技术特征摘要】
1.一种同时检测猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的PCR方法，其特征包括：(1)针对猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型设计能够检测同时检测毒的特异性引物；(2)将用于检测猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的引物置于同一反应管中，使用PCR扩增仪进行PCR反应。2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的PCR检测方法，其特征在于步骤(1)所述的特异性引物对序列为：PCV3F：TTACTTAGAGAACGGACTTGTAACGPCV3R：AAATGAGACACAGAGCTATATTCAGPCV2F：TTTCAG...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙文超，赵翠青，鲁会军，李霄，金宁一，田明尧，汪伟，曹亮，
申请(专利权)人：温州大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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