一种监测土壤中甲烷氧化菌的方法技术

技术编号:18414196 阅读:35 留言:0更新日期:2018-07-11 07:13
本发明专利技术提供了一种监测土壤中甲烷氧化菌的方法,其包括如下步骤:步骤一:以pmoA基因的标准品和提取的待测土样中的总DNA分别作为DNA模板、以SYBR Green作为染料以及以能够扩增包含在所述pmoA基因内的序列的引物进行实时荧光定量PCR;步骤二:建立所述pmoA基因的标准曲线,并根据所述标准曲线确定所述待测土样中的所述pmoA基因的拷贝数。本发明专利技术不需要对微生物进行培养,通过系统发育以及功能基因探针的方法来直接分析土壤样品中的油气微生物。

A method for monitoring methane oxidizing bacteria in soil

The present invention provides a method for monitoring methane oxidizing bacteria in soil. The steps are as follows: Step 1: using the standard pmoA gene and the total DNA in the extracted soil sample as the DNA template, the SYBR Green as the dye, and the primers that can amplify the sequence contained in the pmoA gene. Quantitative PCR; step two: establish the standard curve of the pmoA gene and determine the copy number of the pmoA gene in the measured soil sample according to the standard curve. The invention does not need to culture microorganisms, and directly analyzes oil and gas microbes in soil samples by means of phylogenetic analysis and functional gene probes.

【技术实现步骤摘要】
一种监测土壤中甲烷氧化菌的方法
本专利技术涉及一种油气勘探领域的检测方法,尤其涉及一种监测土壤中甲烷氧化菌的方法。
技术介绍
油气微生物勘探法主要研究近地表土壤层中微生物异常与地下深部油气藏的相关关系。油气微生物勘探技术能为初期勘探提供廉价有效的方法和指示,能预测有利勘探区块以降低勘探风险。而在勘探成熟区,这项技术能将地震勘探查明的地质构造划分成各种含烃级别,并以指示油、气、水的分布位置来为油气藏开发中的油气藏表征服务。其核心在于检测和油气利用相关的微生物数量及其活性,从而判断地下油气藏的分布和有无。因此,油气指示微生物的检测技术成为整个微生物勘探法的最重要的内容之一。传统的微生物勘探主要以培养法为主,前苏联Kartsev等(1959)采用了一种最简单的方法来测定土壤中的烃消耗细菌。把土壤放入培养反应器,随后注入一定量的无机盐培养溶液并在顶空加入一定比例的丙烷或丁烷气体。培养一段时间后,根据培养基表面的菌膜厚度来估算细菌的数量和活性。这种方法虽然在早期取得了一些效果,但由于其受主观判断的影响较大,培养时间较长,误探率也较高,逐渐被淘汰。另一种是气体利用检测法,其原理是测定培养过程中被烃氧化细菌消耗烃的量。Taggart等(U.S.PatentNO.2349472)构建了一系列较复杂的气体分压测试装置,监测培养时间内挥发性烃分压的变化,间接表征了土壤中的烃氧化细菌数量。这种方法的缺点在于培养时间特别长,通常需要数周时间。另外环境中很多微生物具有烃降解能力,在长期的驯化后,或多或少会表现出一定的烃消耗活性。为了克服以上缺点,Hitzman等(U.S.PatentNO.2880142)采用了平板计数法或滚管法来直接测定土壤中的烃氧化微生物。他在培养基中加入高浓度毒性物质为唯一碳源来培养烃氧化菌,而这些毒性物质(如醇,醛等)可以抑制其他土壤微生物的生长。但是这种方法的缺点也是周期长,而且一般都是通过计数平板上的菌落数。琼脂本身也是一种碳源,不可避免地会造成假阳性。除此以外,中石化无锡石油地质研究团队以最大可能数法为基础建立了多种与油气相关微生物的检测方法,经过评估虽然该方法稳定,但检测通量低,所得数据介于半定量和定量之间。随后该项目组结合医学上的酶标检测仪建立了高通量检测方法,由于色度检测非常灵敏,易受到主观和客观因素的干扰,但在严格控制各个操作环节下,该方法稳定、准确,检测周期短。作为经典的培养检测方法,项目组建立了稀释平板法,该方法同时考虑微生物数量和活性,该方法的缺点在于对于操作人员和耗材的需求量较大。由此可见,现有的传统的以培养为主的测试技术和测试手段存在干扰因素稍多、操作较复杂、样品保存难度高、耗时较长,不能检测不可培养的烃氧化菌,同时特异性较低,计数使用平板法、MPN法,定量不准确等缺陷,还不能满足实际生产的要求,鉴于此,很有必要开发一种高效免培养的定量检测烃氧化微生物方法,从而提高油气化探的准确性和可靠性。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的问题,本专利技术提供了一种监测土壤中甲烷氧化菌的方法,其包括如下步骤:步骤一:以pmoA基因的标准品和提取的待测土样中的总DNA分别作为DNA模板、以SYBRGreen作为染料以及以能够扩增包含在所述pmoA基因内的序列的引物进行实时荧光定量PCR;步骤二:建立所述pmoA基因的标准曲线,并根据所述标准曲线确定所述待测土样中的所述pmoA基因的拷贝数。针对油气微生物的实时荧光基因定量检测方法,利用定量PCR技术扩增甲烷(烃)氧化菌的功能基因来检测其存在和数量,从而高效快速准确地检测样品中可编码甲烷氧化菌的功能基因(例如pmoA基因)的数量,从而更加精确的指导微生物勘探。在使用实时荧光定量PCR方法中,如果检测靶标基因需要达到检测灵敏度更高、特异性更强、重复性更好以及定量更准确的特性,则需要选择合适的实时荧光定量PCR体系,否则也难以实现检测灵敏度更高、特异性更强、重复性更好以及定量更准确的特性。对实时荧光定量PCR体系影响最为关键的组分包括引物序列的选择。因为实时定量的引物设计要求比较高,设计时要注意扩增的片段不能太大,本专利技术的专利技术人通过实验证实,在本专利技术中,扩增的片段最好在250bp-100bp之间,并且扩增的片段要尽可能的保守,避免存在碱基突变;避免引物自身或与引物之间形成连续配对;避免引物自身形成环状的发卡结构;避免引物之间的TM值相差超过2℃;同时要保证这对引物有绝对的特异性,因为要是产生非特异性扩增的话,就不能准确的计量模板量了,这样就失去了实时定量的意义了。在本专利技术的一个具体实施方式中,用于扩增所述pmoA基因的引物对包括如SEQIDNo.1所示的上游引物序列,和如SEQIDNo.2所示的下游引物序列。本专利技术所用的术语“油气微生物”是指近地表土壤层中与地下深部油气藏存在相互关系的微生物。在本专利技术的一个优选的实施方式中,所述油气微生物是指烃消耗微生物,尤其是烃消耗菌。在本专利技术的一个优选的实施方式中,所述油气微生物是指烃氧化微生物,尤其是烃氧化菌。在本专利技术的一个具体实施方式中,使用含有所述SYBRGreen的SYBRPremixExTaqPerfectRealTime(染料法实时定量荧光)试剂盒来进行实时荧光定量PCR。所述实时荧光定量PCR的配制的体系为:1倍体积的SYBRPremixExTaqPerfectRealTime,分别为15-25μmol·L-1的上游引物和下游引物,1-10ng的DNA模板。在本专利技术的一个优选的实施方式中,所述实时荧光定量PCR的配制的总体系为20μl,各组分的加入量分别为:10μlSYBRPremixExTaqPerfectRealTime,分别为16-20μmol·L-1的上游引物和下游引物,3-5ng的DNA模板。在本专利技术的一个优选的实施方式中,荧光定量PCR的扩增条件为:1)92-98℃25-35s;2)92-98℃7-13s,3)50-60℃25-35s,4)70-74℃25-35s,5)77-83℃3-7s,6)从步骤2)至步骤5)循环30-45次;7)62-68℃3-7s;优选1)95℃30s;2)95℃10s,3)55℃30s,4)72℃30s,5)80℃5s,6)从步骤2)至步骤5)循环35-42次;7)65℃5s专利技术人研究发现,进行所述实时荧光定量PCR时,采用冷启动的方式。也就是,在配制体系过程中在零度以下进行,否则,PCR扩增过程中容易产生引物二聚体以及非特异性条带的扩增,这样会严重的干扰结果的准确性,特别是在模板含量较低时,例如在模板含量为0.5-1.5ng时。对本专利技术的实时荧光定量PCR准确性的另外一个比较关键的因素是需要有一定浓度的pmoA基因定量标准品。因此,在本专利技术中,针对甲烷氧化菌的功能基因pmoA基因第一次构建出标准品。因此,所述方法还包括在步骤一之前的步骤A:制备所述pmoA基因的实时荧光定量PCR的标准品。在本专利技术的一个优选的实施方式中,所述pmoA基因实时荧光定量PCR的标准品制备步骤如下:I)将所述pmoA基因进行克隆,获得存在于宿主细胞中的含有所述pmoA基因的克隆载体;II)从宿主细胞提取所述步骤I)中的所述克隆载体,并使所述克隆载体线性化;III)采用光度适应计本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种监测土壤中甲烷氧化菌的方法,其包括如下步骤:步骤一:以pmoA基因的标准品和提取的待测土样中的总DNA分别作为DNA模板、以SYBR Green作为染料以及以能够扩增包含在所述pmoA基因内的序列的引物进行实时荧光定量PCR;步骤二:建立所述pmoA基因的标准曲线,并根据所述标准曲线确定所述待测土样中的所述pmoA基因的拷贝数。

【技术特征摘要】
1.一种监测土壤中甲烷氧化菌的方法,其包括如下步骤:步骤一:以pmoA基因的标准品和提取的待测土样中的总DNA分别作为DNA模板、以SYBRGreen作为染料以及以能够扩增包含在所述pmoA基因内的序列的引物进行实时荧光定量PCR;步骤二:建立所述pmoA基因的标准曲线,并根据所述标准曲线确定所述待测土样中的所述pmoA基因的拷贝数。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,用于扩增所述pmoA基因的引物对包括如SEQIDNo.1所示的上游引物序列,和如SEQIDNo.2所示的下游引物序列。3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,使用含有所述SYBRGreen的SYBRPremixExTaqPerfectRealTime试剂盒来进行实时荧光定量PCR。4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述实时荧光定量PCR的配制的体系为:1倍体积的SYBRPremixExTaqPerfectRealTime,分别为15-25μmol·L-1的上游引物和下游引物,1-10ng的DNA模板。5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述实时荧光定量PCR的配制的总体系为20μl,各组分的加入量分别为:10μlSYBRPremixExTaqPerfectRealTime,分别为16-20μmol·L-1的上游引物和下游引物,3-5ng的DNA模板。6....

【专利技术属性】
技术研发人员:黄欣许科伟汤玉平杨帆杨俊高俊阳任春
申请(专利权)人:中国石油化工股份有限公司中国石油化工股份有限公司石油勘探开发研究院
类型:发明
国别省市:北京,11

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