一种等温扩增反应的优化方法技术

本发明专利技术主要涉及生物技术领域，公开了一种等温扩增反应的优化方法，包括：互补杂交、等温扩增；方法简单，便于操作，无需特殊试剂和大型设备，成本低廉，能够有效避免等温扩增反应的非特异性扩增，提高扩增产物的纯度和扩增速率，避免对等温扩增反应及后续试验的干扰。

An optimization method for isothermal amplification reaction

The invention mainly relates to the field of biological technology, and discloses an optimization method for isothermal amplification reaction, including: complementary hybridization and isothermal amplification, simple method, easy operation, no special reagents and large equipment, low cost, can effectively avoid non specific amplification of isothermal amplification reaction, and improve the purity of the amplified product. And the amplification rate to avoid interference to isothermal amplification reaction and subsequent experiments.

【技术实现步骤摘要】
一种等温扩增反应的优化方法
本专利技术主要涉及生物
，尤其涉及一种等温扩增反应的优化方法。
技术介绍
核酸扩增是实现高灵敏度检测核酸的重要手段。目前常用的核酸扩增技术是聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction，PCR)，但PCR需要精确的热循环和严格的反应条件。近年来，核酸的等温扩增技术得到了迅速发展，等温扩增反应是建立的一种新型的核酸扩增技术，结合DNA聚合酶催化的延伸反应及切刻内切酶的剪切作用，可以在等温条件下，短时间内对目标核酸分子扩增数倍。该技术具有简便、快速的显著优点，其扩增倍数可与PCR媲美，等温扩增反应也叫链置换扩增反应，是一种高效的恒温DNA扩增技术；但是传统的标准等温扩散过程中，通常表现出在没有加入引物时却有扩增产物，包括扩增产物和模板的结合形成的双链，同时，在引物的浓度逐渐增大时，并没有扩增产物的相应梯度表现，出现了错误的扩增信号，这就属于非特异性扩增，给试验造成了很大的困扰。
技术实现思路
为了弥补已有技术的缺陷，本专利技术的目的是提供一种等温扩增反应的优化方法。一种等温扩增反应的优化方法，包括以下步骤：（1）互补杂交：分别吸取3μL引物单链X、3μL质量浓度为1μM模板链X’-Y’、3μL质量浓度为2.5mM的dNTPs、15.2μL超纯水，混合均匀，先于95℃孵育5min，再于55℃孵育5min，得杂交链；（2）等温扩增：将复合酶溶液置于55℃孵育5min，加入杂交链中，混合均匀，于55℃孵育8min，再置于95℃保温10min，置于-20℃备用，得单链Y-G4-DNA。所述步骤（2）中的复合酶溶液，由以下重量份的原料制成：8U/μL的BstDNA聚合酶0.1μL、10×的聚合酶反应缓冲溶液3μL、质量浓度为10U/μL的Nt.BstNBI切克内切酶1.2μL、10×的Nt.BstNBI切克内切酶反应缓冲溶液1.5μL。本专利技术的优点是：本专利技术提供的等温扩增反应的优化方法，方法简单，便于操作，无需特殊试剂和大型设备，成本低廉，能够有效避免等温扩增反应的非特异性扩增，提高扩增产物的纯度和扩增速率，避免对等温扩增反应及后续试验的干扰。附图说明图1为传统方法的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；图2为本专利技术中优化方法的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。附图标记说明：图1：1：仅有终浓度为0.2μM的X；2：仅有终浓度为0.2μM的X’-Y’模板；3：无X，终浓度为0.2μM的X’-Y’模板，经过xy反应过程；4：终浓度为0.04μM的X，0.2μMX’-Y’模板，经过xy反应过程；5：终浓度为0.08μM的X，0.2μMX’-Y’模板，经过xy反应过程；6：终浓度为0.12μM的X，0.2μMX’-Y’模板，经过xy反应过程；7：终浓度为0.16μM的X，0.2μMX’-Y’模板，经过xy反应过程；8：终浓度为0.2μM的X，0.2μMX’-Y’模板，经过xy反应过程；9：仅有终浓度为0.2μM的Y。图1：1：Marker；2：无X，终浓度为0.1μM的X’-Y’模板，经过xy反应过程；3：终浓度为0.3nM的X，0.1μMX’-Y’模板，经过xy反应过程；4：终浓度为1nM的X，0.1μMX’-Y’模板，经过xy反应过程；5：终浓度为3nM的X，0.1μMX’-Y’模板，经过xy反应过程；6：终浓度为10nM的X，0.1μMX’-Y’模板，经过xy反应过程；7：终浓度为30nM的X，0.1μMX’-Y’模板，经过xy反应过程；8：终浓度为50nM的X，0.1μMX’-Y’模板，经过xy反应过程；9：终浓度为70nM的X，0.1μMX’-Y’模板，经过xy反应过程；10：终浓度为90nM的X，0.1μMX’-Y’模板，经过xy反应过程；11：终浓度为100nM的X，0.1μMX’-Y’模板，经过xy反应过程；12：终浓度为150nM的X，0.2μMX’-Y’模板，经过xy反应过程；13：终浓度为200nM的X，0.2μMX’-Y’模板，经过xy反应过程。具体实施方式下面用具体实施例说明本专利技术。实施例1一种等温扩增反应的方法，包括以下步骤：（1）互补杂交：分别吸取3μL引物单链X、3μL质量浓度为1μM模板链X’-Y’、3μL质量浓度为2.5mM的dNTPs、15.2μL超纯水，混合均匀，先于95℃孵育5min，得杂交链；（2）等温扩增：将复合酶溶液加入杂交链中，混合均匀，于55℃孵育20min，再置于95℃保温10min，置于-20℃备用，得单链Y-G4-DNA；所述复合酶溶液，由以下重量份的原料制成：8U/μL的BstDNA聚合酶0.1μL、10×的聚合酶反应缓冲溶液3μL、质量浓度为10U/μL的Nt.BstNBI切克内切酶1.2μL、10×的Nt.BstNBI切克内切酶反应缓冲溶液1.5μL。从图1的电泳图中看出，第三泳道并没有引物单链X但却有扩增产物，包括扩增产物和模板的结合形成的双链，同时，在泳道3~8之间X的浓度逐渐增大，而电泳图上并没有相应的梯度表现，图1中唯一表现出的就是扩增出了单链Y。实施例2一种等温扩增反应的优化方法，包括以下步骤：（1）互补杂交：分别吸取3μL引物单链X、3μL质量浓度为1μM模板链X’-Y’、3μL质量浓度为2.5mM的dNTPs、15.2μL超纯水，混合均匀，先于95℃孵育5min，再于55℃孵育5min，得杂交链；（2）等温扩增：将复合酶溶液置于55℃孵育5min，加入杂交链中，混合均匀，于55℃孵育8min，再置于95℃保温10min，置于-20℃备用，得单链Y-G4-DNA；所述复合酶溶液，由以下重量份的原料制成：8U/μL的BstDNA聚合酶0.1μL、10×的聚合酶反应缓冲溶液3μL、质量浓度为10U/μL的Nt.BstNBI切克内切酶1.2μL、10×的Nt.BstNBI切克内切酶反应缓冲溶液1.5μL。从图2的电泳图中可以看出第二泳道无杂乱条件，说明经过不同时间的孵育，在优化方案下无特异性扩增，同时，随着单链X的浓度的增加，电泳图上各个条带具有规律性的梯度表现，比如泳道2~5表现出模板X’-Y’逐渐变浅直至消失，这是因为逐渐增加浓度的单链X与X’-Y’模板结合，同时扩增出的单链Y也与X’-Y’模板结合形成双链。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种等温扩增反应的优化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）互补杂交：分别吸取3μL引物单链X、3μL质量浓度为1μM模板链X’‑Y’、3μL质量浓度为2.5mM的dNTPs、15.2μL超纯水，混合均匀，先于95℃孵育5min，再于55℃孵育5min，得杂交链；（2）等温扩增：将复合酶溶液置于55℃孵育5min，加入杂交链中，混合均匀，于55℃孵育8min，再置于95℃保温10min，置于‑20℃备用，得单链Y‑G4‑DNA。

【技术特征摘要】
1.一种等温扩增反应的优化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）互补杂交：分别吸取3μL引物单链X、3μL质量浓度为1μM模板链X’-Y’、3μL质量浓度为2.5mM的dNTPs、15.2μL超纯水，混合均匀，先于95℃孵育5min，再于55℃孵育5min，得杂交链；（2）等温扩增：将复合酶溶液置于55℃孵育5min，加入杂交链中，混合均匀，于55℃孵育8min，再置于9...

【专利技术属性】
技术研发人员：张睿，
申请(专利权)人：张睿，
类型：发明
国别省市：安徽,34