一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒及其应用制造技术

技术编号:18414188 阅读:73 留言:0更新日期:2018-07-11 07:12
本发明专利技术公开了一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒及其应用,该试剂盒包括靶向猪线粒体基因组序列的捕获探针,所述的捕获探针由生物素标记的核苷酸序列组成,核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑106所示,获取猪线粒体基因组序列的方法包括以下步骤:1)提取猪的基因组DNA;2)构建猪的全基因组文库;3)与捕获探针液相杂交、测序、序列拼接,即可获取猪线粒体基因组序列,该方法尤其适用于靶向捕获猪古DNA中线粒体基因组序列,其灵敏度高,特异性强,且稳定性好,与核酸文库结合捕获效率更高,覆盖度能达到99.99%,且检测成本低。

A target sequence capture kit for porcine mitochondrial genome and its application

The present invention discloses a porcine mitochondrial genome target sequence capture kit and its application. The kit includes the capture probe that targets the genome sequence of the pig mitochondria. The capture probe is composed of the nucleotide sequence marked by biotin. The nucleotide sequence, such as SEQ ID NO:1 106, obtains the pig mitochondrial genome. The method of sequence includes the following steps: 1) extraction of pig genome DNA; 2) construction of the whole genome library of pigs; 3) the genome sequence of pig mitochondrial genome can be obtained by hybridization, sequencing and sequence splicing of the capture probe. This method is especially suitable for the target capture pig ancient DNA grain genome sequence, and its sensitivity is high. It has strong specificity, good stability and high capture efficiency with a nucleic acid library. The coverage can reach 99.99% and the detection cost is low.

【技术实现步骤摘要】
一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒及其应用
本专利技术属于生物
,具体涉及一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒,还涉及一种获取猪线粒体基因组序列的新方法,以及该捕获试剂盒在获取猪古DNA线粒体基因组序列中的应用。
技术介绍
一般说来,人类历史上的农业革命主要包括栽培作物的产生和驯化动物的起源。系统性探索家畜的起源,对于了解家畜的发展史、揭示家畜对人类生活方式的影响至关重要。众所周知,家猪(Susscrofa)缘自野猪的驯化。目前,野猪分布区域集中在:1)欧亚大陆的南部,即分布于欧洲、北非和亚洲中部天山山脉的欧洲野猪;2)亚洲,即分布于中国大陆、台湾、爪哇、苏门答腊和新几内亚的亚洲野猪(胡耀武和王昌燧,2004年,家猪起源的研究现状与思考)。相比之下,家猪的分布范围要大得多,几乎遍及全世界,其品种也千差万别、多种多样。家猪与野猪在形态和习性上的差别明显,这引发了我们的思考:性情凶猛的野猪是如何驯化为形态、习性迥然不同的家猪呢?家猪起源于何时、何地?系单一起源,抑或多个起源呢?诸如此类,皆为学术界长期关注的问题。多年来,国内外学者从不同角度,孜孜以求地探索家猪的起源与驯化,业已取得颇为丰硕的成果,然而,诸如驯化之初,鉴别家猪和野猪等关键问题,至今仍茫然无绪。自考古学诞生以来,发掘成果日新月异、层出不穷,为探索家猪起源提供了颇为翔实的实物资料。猪的驯化是中国古代最伟大的创造专利技术之一。有报道指出,经过5年田野考察与研究,湖北省文物考古研究所罗运兵博士将中国家猪的起源时间,前推至距今9000年左右。其撰写的《中国古代猪类驯化、饲养与仪式性使用》一书,立足于猪骨遗存本身,运用动物考古学和考古学的理论与方法,并借助相关学科的手段和成果,侧重量化分析,对我国古代猪类遗存进行了多维视角的系统研究。通过与考古学结合,借助分子生物学方法,为研究家猪起源开辟了另一重要途径。分子生物学理论指出,长期的进化道路上,生物的DNA既保持稳定遗传,又容忍偶然变异产生。显然,DNA的遗传稳定性,保证了亲代与子代之间的遗传连续性;而DNA的变异,又使得子代与亲代出现差异,导致了物种的进化。研究表明:突变导致的DNA中核苷酸序列的改变,与时间的累积成正比,即时间越长,DNA中核苷酸序列的改变越大。这种变化的速率是恒定的,两种生物分离的时间越长,其分子的差异则越大,这就是所谓的“分子钟”。这样,若探明现存物种DNA的核苷酸序列,便可望估计它们共同祖先的分离时间,即其物种的起源。由于动物体内的线粒体(MitochondrialDNA,mtDNA)具有母系遗传、变异速率快、拷贝数目多的特点,故常将其作为研究物种系统进化的首选。国内外对古代猪的线粒体DNA研究主要采用PCR扩增的方法,如王志等人通过提取DNA、PCR扩增和测序,结合现代不同品种家猪、野猪及黄河中下游猪古DNA序列信息,系统分析了我国黄河流域家猪的起源驯化关系(王志等,利用古DNA信息研究黄河流域家猪的起源驯化,2012年,科学通报)。其通过实验共获得5个古代猪样本mtDNAD-loop基因的179bp的DNA序列,包括2个湖北青龙泉遗址样本和3个青海喇家遗址样本。因为古DNA分子完整性受保存环境影响,容易出现碎片化,导致PCR技术难以扩增目的片段。如王志等人研究仅能获得179bp的基因片段。为获取尽可能长的猪古DNA线粒体基因组序列,本专利技术中,我们提供了一种可避免现代动物基因组污染的古DNA提取方法,其次是设计和合成了猪线粒体基因组捕获芯片,再利用基于核酸探针液相杂交捕获测序技术和生物信息学手段,可最大限度获得猪古DNA线粒体基因组的序列信息。通过实验证明,本专利技术提供的方法不受古DNA碎片化影响,其检测灵敏度高,获取的古DNA线粒体基因组全长序列覆盖度高。本专利技术的方法不仅可进行猪种起源和演化研究,而且可用于筛查现代猪线粒体基因组序列中核苷酸序列变异,也可为调查猪遗传资源分布和猪源性食品成分检测提供新的手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒,该试剂盒可靶向捕获完整的猪线粒体基因组序列,检测灵敏度高,样本起始量低至纳克级,采用高通量测序时,平均测序深度为300x,覆盖度高达99.99%,且检测成本低。本专利技术的另一个目的在于提供一种获取猪线粒体基因组序列的新方法,利用捕获探针与猪的基因组文库液相杂交、测序,可最大限度获得猪线粒体基因组的全长序列。本专利技术的再一个目的在于提供一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒在获取猪古DNA线粒体基因组序列中的应用。为了实现上述的目的,本专利技术采用以下技术方案:一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒,包括猪线粒体基因组序列的捕获探针,所述的捕获探针由生物素标记的核苷酸序列组成,核苷酸序列如SEQIDNO:1-106所示,制备方法如下:1)从NCBI公共数据库下载174个不同品种或个体的猪线粒体基因组全长序列,对这些序列进行比对提取保守区共有序列,进而与非保守序列进行全长拼接;2)针对比对后保守和非保守区域设计特异RNA探针,每条探针长度为151bp,可靶向不同品种的猪线粒体基因组探针集合共有106条,序列如SEQIDNO:1-106所示;3)采用原位合成技术,在芯片上大量合成设计的探针,并利用多聚合酶链式反应或转录的方法扩增出大量带有生物素标记的探针,由此制作特异的猪线粒体基因组序列捕获探针。一种获取猪线粒体基因组序列的新方法,包括以下步骤:1)提取猪的基因组DNA;A.取猪牙齿或骨骼的特定部位去除污染表层之后磨成粉末;B.在上述骨粉中加入裂解液和蛋白酶K分别孵育30min,进行预消化之后离心去掉上清液,再加入裂解液和蛋白酶K进行正式消化24h,所述的裂解液含有0.5MEDTA和0.5%的SDS;C.用商业化的硅离心柱试剂盒对DNA进行浓缩富集;2)构建猪的全基因组文库A.末端补平;B.接头连接:将SOLiD接头1(5′-TGTAACATCACAGCATCACCGCCATCAGTCT-3′)和接头2(5′-GACTGATGGCGCACTACGACACTACAATGT-3′)与末端补平的DNA连接;C.回收纯化连接含SOLiD接头的DNA;D.采用切口平移法进行文库模板量的平衡线性扩增,正向引物:5′-TGTAACATCACAGCATCACCGCCATCAGTCT-3′和反向引物5′-GACTGATGGCGCACTACGACACTACAATGT-3′;3)猪线粒体全基因捕获探针捕获测序A.液相杂交:取制备好的猪基因组文库,先加入鲑鱼精子DNA、人胎盘Cot-1DNA进行封闭反应,然后与生物素化RNA探针杂交,磁珠分选和洗脱纯化;B.捕获测序:取杂交捕获的DNA,进行PCR扩增反应,正向引物:5'-CGCTCAGCGGCCGCAGCATCACCGCCATCAGT-3'和反向引物:5'-CGCTCAGCGGCCGCGTCGTAGTGCGCCATCAGT-3',纯化回收的DNA进行测序,对测序序列拼接,即得到线粒体基因组序列。与现有技术相比,本专利技术具有以下优点及有益效果:1、本专利技术公开了一种获取猪线粒体基因组序列的新方法,并提供了适用于从古代猪遗留的牙齿或骨骼来源样品中提取DNA的方法。2、本专利技术提供的猪线粒体基因本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒,其特征在于,包括猪线粒体基因组序列的捕获探针,所述的捕获探针由生物素标记的核苷酸序列组成,核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑106所示。

【技术特征摘要】
1.一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒,其特征在于,包括猪线粒体基因组序列的捕获探针,所述的捕获探针由生物素标记的核苷酸序列组成,核苷酸序列如SEQIDNO:1-106所示。2.一种靶向捕获猪线粒体基因组序列的新方法,包括以下步骤:1)提取猪的基因组DNA;2)构建猪的全基因组文库:A.末端补平;B.接头连接:将SOLiD接头15′-TGTAACATCACAGCATCACCGCCATCAGTCT-3′和接头25′-GACTGATGGCGCACTACGACACTACAATGT-3′与末端补平的DNA连接;C.回收纯化含SOLiD接头的DNA;D.采用切口平移法进行文库模板量的平衡线性扩增,正向引物:5′-TGTAACATCACAGCATCACCGCCATCAGTCT-3′和反向引物5′-GACTGATGGCGCACTACGACACTACAATGT-...

【专利技术属性】
技术研发人员:赵书红谢胜松倪攀陈俭海李世军韩晓松刘向东杜小勇马云龙赵长志
申请(专利权)人:华中农业大学
类型:发明
国别省市:湖北,42

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