禽致病性大肠杆菌等的多重PCR检测引物组、方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种用于禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR引物组、包括该引物组的多重PCR检测试剂盒以及利用该引物组的多重PCR检测方法，引物组包括：特异性扩增禽大肠杆菌phoA基因的引物对PhoA‑F和PhoA‑R；特异性扩增多杀性巴氏杆菌KMT1基因的引物对KMT‑F和KMT‑R；特异性扩增奇异变形杆菌AtpD基因的引物对AtpD‑F和AtpD‑R；特异性扩绿脓杆菌PETA基因的引物对PETA‑F和PETA‑R；特异性扩增沙门氏菌InvA基因的引物对InvA‑F和InvA‑R；特异性扩增金黄色葡萄球菌nuc基因的引物对NuC‑F和NuC‑R。

Multiplex PCR detection primers, methods and kits for avian pathogenic Escherichia coli

The invention provides a multiple PCR primer group for avian pathogenic Escherichia coli, Pasteurella pasteuricus, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella and Staphylococcus aureus, multiple PCR detection kits including the primer group, and multiple PCR detection methods using the primer group. The primer group includes: specificity Primers for amplification of the phoA gene of avian Escherichia coli, PhoA F and PhoA R, and primers for specific amplification of the KMT1 gene of Pasteurella multocida, KMT F and KMT R, and primers for specific amplification of the AtpD gene of Proteus mirabilis The primers for amplification of InvA gene of Salmonella spp. were InvA and F InvA and InvA R; the primers for specific amplification of Staphylococcus aureus NUC gene were NuC F and NuC R.

【技术实现步骤摘要】
禽致病性大肠杆菌等的多重PCR检测引物组、方法及试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR引物组、包括该引物组的多重PCR检测试剂盒以及利用该引物组的多重PCR检测方法。
技术介绍
禽致病性大肠杆菌(AvianpathogenicEscherichiacoli,APEC)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)，奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)，绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、沙门菌(Salmonella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是危害养禽业的主要病原微生物。禽致病性大肠杆菌感染禽类后，出现肝肿大、肠道粘膜出血和溃疡、心包发炎等症状，该菌血清型众多，存在广泛的耐药性,不易控制,由于防控过程中抗生素的大量使用，易造成禽产品中的药物残留,严重影响人体健康和导致公共卫生问题。禽巴氏杆菌病又名禽霍乱，由多杀性巴氏杆菌引起。该病主要引发成年鸡出现急性败血性症状或传染性肺炎，具有较高的死亡率以及由此导致的生产性能低下等特点。奇异变形杆菌是多发生于雏鸡，以肢体瘫痪和水样腹泻为主要特征的急性传染病。绿脓杆菌主要危害10日龄内的雏鸡，以拉稀、呼吸困难、皮下水肿为特征，已成为威胁养鸡业发展的主要疾病之一。沙门菌有2000多个血清型，部分血清型可以导致人和动物感染。由鸡白痢沙门菌所引起的称为鸡白痢，由鸡伤寒沙门菌引起的称为禽伤寒，沙门菌主要经卵传递，消化道、呼吸道和损伤的皮肤或粘膜感染，雏鸡发病率、死亡率最高。金黄色葡萄球菌感染禽类后，病禽出现败血症、脐炎和关节炎等多种临床症状，该菌存在严重的多重耐药性，可通过皮肤外伤或黏膜破损而感染,也可以经呼吸道而感染。目前对这些病原细菌的检测,主要依靠常规的细菌学培养方法,耗时长，操作繁琐，费时耗力。用于病原细菌检测的方法包括乳胶凝集法、免疫磁珠分离法、酶免疫测定法、核酸杂交和PCR技术等。PCR技术因其特异性强、敏感性高、操作简单快速而得到广泛应用，但这些方法每次实验通常只能检测一种或几种病原细菌。多重PCR(MultiplexPCR)技术是基于常规PCR发展来的DNA片段扩增技术，可实现在同一反应体系中检测多种病原菌。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术采用了如下技术方案：本专利技术的一个目的是提供一种能够准确、快速、稳定、特异性和灵敏性高的检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的引物组，其特征在于，包括：特异性扩增禽大肠杆菌phoA基因的引物对PhoA-F和PhoA-R；特异性扩增多杀性巴氏杆菌KMT1基因的引物对KMT-F和KMT-R；特异性扩增奇异变形杆菌AtpD基因的引物对AtpD-F和AtpD-R；特异性扩绿脓杆菌PETA基因的引物对PETA-F和PETA-R；特异性扩增沙门氏菌InvA基因的引物对InvA-F和InvA-R；特异性扩增金黄色葡萄球菌nuc基因的引物对NuC-F和NuC-R；各个引物的核苷酸序列分别为：PhoA-F，5’-GCACTCTTACCGTTACTGTTTACCCC-3’；PhoA-R，5’-TTGCAGGAAAAAGCCTTTCTCATTTT-3’；KMT-F，5’-TTAACAGAGAGGTGAAAAATACCCCTA-3’；KMT-R，5’-CTTTACGCTGATTAATATTGTGCTGAC-3’；AtpD-F，5’-CTGGTGGCTCATTCATCT-3’；AtpD-R，5’-ACAGTTAGGCGGTGGTAT-3’；PETA-F，5’-TTCGTCAGGGCGCACGAGAGCAACGAG-3’；PETA-R，5’-GAAGGTCTCCAGCGGCAGGTGGCAAGC-3’；InvA-F，5’-AACCAGCAAAGGCGAGCAG-3’；InvA-R，5’-CAATACGATGCTGTTATCGTCCAG-3’；NuC-F，5’-CCTGAAACAAAGCATCCTAAAAAAG-3’；NuC-R，5’-TAAATATACGCTAAGCCACGTCCAT-3’。本专利技术提供的引物组，还具有这样的特征：引物对PhoA-F和PhoA-R用于扩增的目的片段的大小为1001bp；引物对KMT-F和KMT-R用于扩增的目的片段的大小为755bp；引物对AtpD-F和AtpD-R用于扩增的目的片段的大小为509bp；引物对PETA-F和PETA-R用于扩增的目的片段的大小为363bp；引物对InvA-F和InvA-R用于扩增的目的片段大小为256bp；引物对NuC-F和NuC-R用于扩增的目的片段大小为155bp。本专利技术的另一个目的是提供一种检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，基于待检测细菌制备得到PCR模板；步骤2，制备特异性引物组，采用权利要求1或2中任意一项所述的引物组制备得到特异性引物组；步骤3，进行PCR扩增反应，基于步骤1得到的所述PCR模板，采用步骤2得到的特异性引物组建立得到包括所述引物组的PCR反应体系，然后采用该PCR反应体系在预定PCR反应参数条件下进行PCR扩增反应得到PCR扩增产物；步骤4，进行电泳检测，对所述扩增产物进行电泳检测得到电泳结果，根据所述电泳结果判定是否出现所述禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌或金黄色葡萄球菌。本专利技术提供的多重PCR检测方法，还具有这样的特征：步骤3的PCR反应体系包括：2.5μL的10×反应缓冲液，0.125μL的浓度为8,000U/mL的ExTaq聚合酶、2.5μL的浓度为2.5mMeach的dNTP、2μL的浓度为25mM的Mg2+、1μL的所述PCR模板、10μL的超纯水，和所述引物组，在所述引物组中，引物对PhoA-F和PhoA-R的体积各为1.25μL，引物对KMT-F和KMT-R的体积各为0.5μL，引物对AtpD-F和AtpD-R的体积各位0.5μL，引物对PETA-F和PETA-R的体积各为1.0μL、引物对InvA-F和InvA-R的体积各为1.0μL、引物对NuC-F和NuC-R的体积各为1.0μL。本专利技术提供的多重PCR检测方法，还具有这样的特征：制备特异性引物组时，所述引物组中使用的各个引物的浓度为10μM。本专利技术提供的多重PCR检测方法，还具有这样的特征：所述预定PCR反应参数条件为94℃预变性4min；94℃变性40s，58℃退火30s，72℃延伸1min，进行25个循环；72℃延伸10min。本专利技术提供的多重PCR检测方法，还具有这样的特征：步骤4的具体过程为，向所述PCR扩增产物中加入5uL6×loadingbuffer并混匀后得到混匀产物，取10uL所述混匀产物点样于1.0％琼脂糖凝胶电泳板孔中，在120V电压下，电泳25min，于凝胶成像系统下拍照得到电泳结果，根据电泳结果判断检测结果。本专利技术还提供了一种根据上述的引物组在制备用于检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR的引物组，其特征在于，包括：特异性扩增禽大肠杆菌phoA基因的引物对PhoA‑F和PhoA‑R；特异性扩增多杀性巴氏杆菌KMT1基因的引物对KMT‑F和KMT‑R；特异性扩增奇异变形杆菌AtpD基因的引物对AtpD‑F和AtpD‑R；特异性扩绿脓杆菌PETA基因的引物对PETA‑F和PETA‑R；特异性扩增沙门氏菌InvA基因的引物对InvA‑F和InvA‑R；特异性扩增金黄色葡萄球菌nuc基因的引物对NuC‑F和NuC‑R；各个引物的核苷酸序列分别为：PhoA‑F，5’‑GCACTCTTACCGTTACTGTTTACCCC‑3’；PhoA‑R，5’‑TTGCAGGAAAAAGCCTTTCTCATTTT‑3’；KMT‑F，5’‑TTAACAGAGAGGTGAAAAATACCCCTA‑3’；KMT‑R，5’‑CTTTACGCTGATTAATATTGTGCTGAC‑3’；AtpD‑F，5’‑CTGGTGGCTCATTCATCT‑3’；AtpD‑R，5’‑ACAGTTAGGCGGTGGTAT‑3’；PETA‑F，5’‑TTCGTCAGGGCGCACGAGAGCAACGAG‑3’；PETA‑R，5’‑GAAGGTCTCCAGCGGCAGGTGGCAAGC‑3’；InvA‑F，5’‑AACCAGCAAAGGCGAGCAG‑3’；InvA‑R，5’‑CAATACGATGCTGTTATCGTCCAG‑3’；NuC‑F，5’‑CCTGAAACAAAGCATCCTAAAAAAG‑3’；NuC‑R，5’‑TAAATATACGCTAAGCCACGTCCAT‑3’。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR的引物组，其特征在于，包括：特异性扩增禽大肠杆菌phoA基因的引物对PhoA-F和PhoA-R；特异性扩增多杀性巴氏杆菌KMT1基因的引物对KMT-F和KMT-R；特异性扩增奇异变形杆菌AtpD基因的引物对AtpD-F和AtpD-R；特异性扩绿脓杆菌PETA基因的引物对PETA-F和PETA-R；特异性扩增沙门氏菌InvA基因的引物对InvA-F和InvA-R；特异性扩增金黄色葡萄球菌nuc基因的引物对NuC-F和NuC-R；各个引物的核苷酸序列分别为：PhoA-F，5’-GCACTCTTACCGTTACTGTTTACCCC-3’；PhoA-R，5’-TTGCAGGAAAAAGCCTTTCTCATTTT-3’；KMT-F，5’-TTAACAGAGAGGTGAAAAATACCCCTA-3’；KMT-R，5’-CTTTACGCTGATTAATATTGTGCTGAC-3’；AtpD-F，5’-CTGGTGGCTCATTCATCT-3’；AtpD-R，5’-ACAGTTAGGCGGTGGTAT-3’；PETA-F，5’-TTCGTCAGGGCGCACGAGAGCAACGAG-3’；PETA-R，5’-GAAGGTCTCCAGCGGCAGGTGGCAAGC-3’；InvA-F，5’-AACCAGCAAAGGCGAGCAG-3’；InvA-R，5’-CAATACGATGCTGTTATCGTCCAG-3’；NuC-F，5’-CCTGAAACAAAGCATCCTAAAAAAG-3’；NuC-R，5’-TAAATATACGCTAAGCCACGTCCAT-3’。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：引物对PhoA-F和PhoA-R用于扩增的目的片段的大小为1001bp；引物对KMT-F和KMT-R用于扩增的目的片段的大小为755bp；引物对AtpD-F和AtpD-R用于扩增的目的片段的大小为509bp；引物对PETA-F和PETA-R用于扩增的目的片段的大小为363bp；引物对InvA-F和InvA-R用于扩增的目的片段大小为256bp；引物对NuC-F和NuC-R用于扩增的目的片段大小为155bp。3.一种禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，基于待检测细菌制备得到PCR模板；步骤2，制备特异性引物组，采用权利要求1或2中任意一项所述的引物组制备得到特异性引物组；步骤3，进行PCR扩增反应，基于步骤1得到的所述PCR模板，采用步骤2得到的特异性引物组建立得到包括所述引物组的PCR反应体系，然后采用该P...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩先干，王志豪，祁克宗，左佳坤，龚建森，苗晋锋，陈兆国，蒋蔚，王少辉，米荣升，黄燕，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31