一种转基因作物双重基因的可视化定量筛查新方法技术

本发明专利技术所建立的基于超快速PCR和胶体金免疫层析试纸的筛查方法和生物传感器，使转基因作物的整体筛查时间控制在10分钟左右，比传统方法更快捷、更灵敏，具备特异性强、灵敏度高、检测结果可靠等优点，可以简化分析检测步骤，缩短分析时间，更重要的是使在线实时检测成为可能，便于携带和野外作业，在转基因作物快速筛查领域，具有非常好的应用前景。

A new method for visual quantitative screening of double genes in transgenic crops

The screening method and biosensor based on ultra fast PCR and colloidal gold immunochromatographic test paper have been established by the invention to control the overall screening time of the transgenic crops for about 10 minutes, faster and more sensitive than the traditional methods, with the advantages of strong specificity, high sensitivity and reliable detection of fruit, which can simplify the analysis and detection. Step, shorten the analysis time, more important is to make on-line real-time detection possible, easy to carry and field work, in the field of rapid screening of genetically modified crops, has a very good application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种转基因作物双重基因的可视化定量筛查新方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种定量筛查转基因作物双重基因的可视化新方法。
技术介绍
自1994年转基因番茄在美国首次商业化种植以来,转基因技术在农业生产领域得到了快速的应用与发展,转基因作物的种植面积逐年扩大,已经对现代农业产生了巨大的冲击和深刻的影响。据国际农业生物技术应用服务组织统计,2014年种植转基因作物的国家达到28个,并且全球转基因作物种植面积由1996年的170万公顷增加到2014年的1.81亿公顷,转基因作物的种植面积增加超过100倍。随着转基因作物种植的迅猛发展,关于转基因生物及其产品成分食用和环境安全性的争议也与日俱增,相应的争议事件也频频出现。巴西坚果过敏事件、帝王蝶事件、墨西哥玉米转基因污染事件、转基因玉米MON863对小鼠肝肾毒性事件、食用转基因玉米Mon810后小鼠免疫表型异常事件及孕妇胎儿血液CryAb1毒素(Bt蛋白)事件等。虽然以上种种争议事件后续都被证实缺乏实验设计、统计或结论的科学性,或者缺少官方正面申明,但是关于对转基因生物及其产品成分食用和环境安全性的怀疑从未停息,还有愈演愈烈的趋势。因此,世界各国都在不同程度上制订了相应的管理制度,主要包括安全性评价制度和转基因成分标识制度等。由于不同国家和地区在转基因产品的阈值范围、标识方式等管理制度上的差异,直接关系到转基因产品的进出口检疫、国际贸易互认等诸多问题,加之转基因生物及其产品成分食用和环境安全性越来越被社会公众所广泛关注,直接推动了转基因检测技术近年来的快速发展和广泛应用。目前国内外对转基因作物及其相关制品的检测主要是基于外源蛋白靶标和外源核酸成分的检测来展开的,建立了一系列常见的快速、灵敏的转基因定性和定量检测技术,如酶联免疫吸附技术(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)、PCR技术、等温扩增技术(isothermalamplification)、基因芯片技术(genechip)及数字PCR技术(digitalPCR,dPCR)等,但在双重基因的超快速、定量、可视化筛查方面还存在诸多问题。
技术实现思路
本专利技术建立的可视化定量筛查新方法，克服了现有筛查技术的不足，实现了对转基因作物进行准确、快速、简单高效的筛查和分析。本专利技术的一个目的是提供一种基因筛查方法，所述方法包括超快速PCR反应,所述超快速PCR反应的反应体系包括上游引物和下游引物；所述上游引物包括带有免疫标记的可特异性扩增待测目标的核苷酸序列，和/或所述下游引物包括带有免疫标记的可特异性扩增待测目标的核苷酸序列；所述超快速PCR反应的反应过程包括：90-98℃，2-6s；50-60℃，2-8s；共20-40个循环。具体的，所述免疫标记包括生物素、Cy5和/或地高辛。具体的，所述标记可在所述可特异性扩增待测目标的核苷酸序列的5’端、3’端和/或任意一个核苷酸上进行标记；所述任一标记的标记方法均属于现有技术。所述可特异性扩增待测目标的核苷酸序列具体包括根据待测目标的特征序列所设计的引物序列；所述特征序列包括现有技术或公知常识所定义的特征序列；所述设计包括现有技术或公知常识所记载的设计方法；所述待测目标包括转基因产品；再具体的，所述待测目标包括转基因产品中的外源基因。具体的，所述超快速PCR反应的反应体系中上游引物和下游引物的浓度为普通PCR浓度的10倍以上；再具体的，为20倍；所述超快速PCR反应的反应体系中还包括DNA聚合酶，所述DNA聚合酶的浓度为普通PCR浓度的10倍以上，再具体的，为60倍。具体的，所述超快速PCR反应的反应过程包括：95℃，4s；58℃，6s；共30个循环。具体的，所述方法还包括下述1)-4)中的至少一种：1)所述上游引物包括：将序列表中SEQID№：1和/或SEQID№：3所示的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；2)所述下游引物包括：将序列表中SEQID№：2和/或SEQID№：4所示的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；3)所述上游引物包括：将序列表中SEQID№：1和/或SEQID№：3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQID№：1和/或SEQID№：3所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；4)所述下游引物包括：将序列表中SEQID№：2和/或SEQID№：4所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQID№：2和/或SEQID№：4所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物。具体的，所述功能包括可实现特异性扩增或检测待测目标。具体的，所述免疫标记包括生物素、Cy5和/或地高辛。具体的，所述标记可在所述可特异性扩增待测目标的核苷酸序列的5’端、3’端和/或任意一个核苷酸上进行标记；所述任一标记的标记方法均属于现有技术。所述可特异性扩增待测目标的核苷酸序列具体包括根据待测目标的特征序列所设计的引物序列；所述特征序列包括现有技术或公知常识所定义的特征序列；所述设计包括现有技术或公知常识所记载的设计方法；所述待测目标包括转基因产品；再具体的，所述待测目标包括转基因产品中的外源基因。再具体的，所述方法还包括下述1)-4)中的至少一种：1)所述上游引物包括：将序列表中SEQID№：1和/或SEQID№：3所示的核苷酸序列的5’端第一个核苷酸进行生物素标记后得到的引物；2)所述下游引物包括：将序列表中SEQID№：2和/或SEQID№：4所示的核苷酸序列的3’端最后一个核苷酸进行Cy5和/或地高辛标记后得到的引物；3)所述上游引物包括：将序列表中SEQID№：1和/或SEQID№：3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQID№：1和/或SEQID№：3所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的5’端第一个核苷酸进行生物素标记后得到的引物；4)所述下游引物包括：将序列表中SEQID№：2和/或SEQID№：4所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQID№：2和/或SEQID№：4所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的3’端最后一个核苷酸进行Cy5和/或地高辛标记后得到的引物；具体的，所述功能包括可实现特异性扩增或检测待测目标。本专利技术的另一个目的是提供一种基因筛查方法，所述方法包括使用胶体金免疫层析试纸进行筛查，所述胶体金免疫层析试纸包括：试纸的C线含有生物素二抗，试纸的T线含有Cy5的抗体和/或地高辛的抗体，试纸的结合垫含有用生物素的抗体制备的胶体金纳米粒子。所述生物素二抗、Cy5的抗体和/或地高辛的抗体喷涂溶液的浓度为1.0mg/mL,喷涂量为1.0μL/cm；所述用生物素的抗体制备的胶体金纳米粒子的喷涂量为2.5μL/cm。本专利技术的还一个目的是提供一种基因筛查方法，所述方法包括先通过本专利技术任一所述方法扩增待测目标，然后再通过胶体金免疫层析试纸检测待测目标。具体的，所述胶体金免疫层析试纸包括：试纸的C线含有本专利技术所述的至少一个免疫标记的二抗，试纸的T线含有本专利技术所述的至少一个免疫标记的抗体，试纸的结合垫含有用本专利技术所述的至本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因筛查方法，其特征在于，所述方法包括超快速PCR反应,所述超快速PCR反应的反应体系包括上游引物和下游引物；所述上游引物包括带有免疫标记的可特异性扩增待测目标的核苷酸序列，和/或所述下游引物包括带有免疫标记的可特异性扩增待测目标的核苷酸序列；所述超快速PCR反应的反应过程包括：90‑98℃，2‑6s；50‑60℃，2‑8s；共20‑40个循环。

【技术特征摘要】
1.一种基因筛查方法，其特征在于，所述方法包括超快速PCR反应,所述超快速PCR反应的反应体系包括上游引物和下游引物；所述上游引物包括带有免疫标记的可特异性扩增待测目标的核苷酸序列，和/或所述下游引物包括带有免疫标记的可特异性扩增待测目标的核苷酸序列；所述超快速PCR反应的反应过程包括：90-98℃，2-6s；50-60℃，2-8s；共20-40个循环。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超快速PCR反应的反应过程包括：95℃，4s；58℃，6s；共30个循环。3.根据权利要求1和/或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括下述1)-4)中的至少一种：1)所述上游引物包括：将序列表中SEQID№：1和/或SEQID№：3所示的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；2)所述下游引物包括：将序列表中SEQID№：2和/或SEQID№：4所示的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；3)所述上游引物包括：将序列表中SEQID№：1和/或SEQID№：3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQID№：1和/或SEQID№：3所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；4)所述下游引物包括：将序列表中SEQID№：2和/或SEQID№：4所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQID№：2和/或SEQID№：4所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物。4.根据权利要求1、2和/或3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括下述1)-4)中的至少一种：1)所述上游引物包括：将序列表中SEQID№：1和/或SEQID№：3所示的核苷酸序列的5’端第一个核苷酸进行生物素标记后得到的引物；2)所述下游引物包括：将序列表中SEQID№：2和/或SEQID№：4所示的核苷酸序列的3’端最后一个核苷酸进行Cy5和/或地高辛标记后得到的引物；3)所述上游引物包括：将序列表中SEQID№：1和/或SEQID№：3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQID№：1和/或SEQID№：3所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的5’端第一个核苷酸进行生物素标记后得到的引物；4)所述下游引物包括：将序列表中SEQID№：2和/或SEQID№：4所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQID№：2和/或SEQID№：4所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的3’端最后一个核苷酸进行Cy5和/或地高辛标记后得到的引物。5.一种基因筛查方法，所述方法包...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文涛，黄昆仑，罗云波，田晶晶，杜再慧，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11