本申请公开了生物技术领域的一种5‑羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法一，包括以下步骤：过夜培养；诱导培养；离心收集：在5000～6000rmp的转速下离心5～10min，然后收集细胞菌体，去除培养基和诱导剂，加入150～200μL的细胞裂解液，并在20～25℃的温度下以5000～6000rmp的转速震荡1h；二次离心：在5000～6000rmp的转速下离心15～20min；提取上清液与显色反应液；检测：将96孔酶标板放入酶标仪中，在560～580nm波长下测定不同时间的光吸收值。采用本申请就能够快速的从大量样本中筛选出活性酶。
A high throughput activity screening method for 5- hydroxymethyl furfural oxidase
This application discloses a high throughput screening method for 5 hydroxy methyl furfural oxidase in the field of biotechnology, including the following steps: overnight culture, induction culture, centrifugation, centrifugation for 5 ~ 10min at the speed of 5000 to 6000rmp, and then collecting cell mycelia, removing medium and inducers, and adding 150~200 mu L The cell lysate, at the temperature of 5000 ~ 6000rmp at 20~25 C, oscillates at 5000 ~ 6000rmp, and the two centrifuge: centrifuge 15 ~ 20min at 5000 ~ 6000rmp speed; extract the supernatant and color reaction liquid; detect the 96 hole enzyme labeled plate in the enzyme labeling instrument and determine the light absorption value at different times at 560 to 580nm wavelengths. With this application, we can quickly select active enzymes from a large number of samples.
【技术实现步骤摘要】
一种5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法。
技术介绍
呋喃-2,5-二羧酸(FDCA)是一种可代替传统材料用于合成高分子多聚物的新型小分子化合物。呋喃-2,5-二羧酸可由生物来源的5-羟甲基糠醛(HMF)经过3步连续的氧化反应生成。目前研究报道了一种来自甲基菌属Methylovorussp.strainMP688的5-羟甲基糠醛氧化酶(HMFO)，研究人员以大肠杆菌中重组表达的HMFO为催化剂，成功的将HMF转化成了FDCA，但催化效率较低。由于该酶催化的反应具有重大的应用价值，因此对酶进行改造以提高其催化效率显得尤为重要。定向进化是改进生物酶的常用有效手段，但需要从大量的突变体中筛选出极少数性质提高的突变体，因此要求对突变库进行快速高效的筛选，而常规的HPLC等筛选方法不仅需要昂贵的检测仪器，而且操作步骤多、费时，无法满足对活性酶进行快速定向进化的要求。另外，如若要从自然界中大批量筛选产HMFO野生菌株，常规的筛选方法也不适合。因此，建立一种快速、准确、低成本和易操作的5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量筛选方法是很有必要的。
技术实现思路
本专利技术意在提供一种5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法，以解决使用现有技术不能对活性酶进行快速筛选的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：一种5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法，包括以下步骤：步骤一、过夜培养：在96孔培养板的孔中均放入100～120μLLB培养基，挑取含5-羟甲基糠醛氧化酶基因的菌株单克隆依次放入孔中，再将96孔培养板放入摇床，在37～40℃的温度下以250～300rmp的转速培养16～20h；步骤二、诱导培养：向96孔培养板的孔中均加入100～120μL且浓度为0.1～0.5mMIPTG的诱导剂，在16～18℃培养20～24h；步骤三、离心收集：在5000～6000rmp的转速下离心5～10min，然后收集细胞菌体，去除培养基和诱导剂，加入150～200μL的细胞裂解液，并在20～25℃的温度下以5000～6000rmp的转速震荡1h；步骤四、二次离心：在5000～6000rmp的转速下离心15～20min；步骤五、提取上清液与显色反应液：从96孔培养板的每个孔中取20～50μL含5-羟甲基糠醛氧化酶蛋白的上清液置于96孔酶标板中，然后在96孔酶标板中加入含有90～100mM磷酸缓冲液、1～20mM底物和10～20μM10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine与6～10U/mL辣根过氧化物酶的显色反应液；步骤六、检测：将96孔酶标板放入酶标仪中，在560～580nm波长下测定不同时间的光吸收值。优选的，步骤一中，所述LB培养基的成分为：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L和NaCl5g/L。优选的，步骤三中，所述细胞裂解液的成分为：100mM磷酸缓冲液(pH＝6.0～8.0)、1mg/L溶菌酶、10mM氯化镁，1U/mLDNA酶I。本专利技术的工作原理及其有益效果为：相比于常规的应用HPLC检测等方法检测5-羟甲基糠醛氧化酶活性，本专利技术建立高通量活性筛选方法具有快速、准确、低成本、易操作和高通量等优点。附图说明图1为5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法原理；图2为pTrcHisB-HMFO表达载体示意图；图3为5-羟甲基糠醛氧化酶在96孔培养板中对底物HMF的活性展示；图4为5-羟甲基糠醛氧化酶在96孔培养板中对底物FFCA的活性展示。具体实施方式下面通过具体实施方式进一步详细的说明：(以下所述，仅是本专利技术的较佳实施例而已，并非对本专利技术作任何形式上的限制，任何未脱离本专利技术技术方案内容，依据本专利技术的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本专利技术技术方案的范围内)。实施例1：根据已报到的HMFO蛋白序列(序列号：WP_013440946)在NCBI中比对获得相应的基因核酸序列，人工合成HMFO基因全长，并在其两端导入BamHI和SalI酶切位点。用BamHI和SalI进行双酶切后，与同样经过BamHI和SalI双酶切的质粒pTrcHis-B进行连接。用T4DNA连接酶，16℃连接4h后，连接产物转化大肠杆菌DH5α。通过图1所示的5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法原理，过夜培养后，挑取长出的单克隆菌落摇菌并提取质粒，获得重组质粒pTrcHis-HMFO，其示意图参见图2。最后将质粒pTrcHis-HMFO转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，甘油(终浓度为20％)保存于-80℃冰箱。实施例2：将保存于甘油中含pTrcHis-HMFO质粒的基因工程菌BL21(DE3)划平板活化后，从平板上挑取46个单克隆至96孔培养板的各个孔中(含100μLLB培养基)，挑取2个pTrcHis-B空质粒的BL21(DE3)菌作为对照。将平板放入摇床，在37℃下以250rpm的转速培养过夜(约16h)后，向96孔培养板孔中加入100μL含0.2mM浓度诱导剂(诱导剂终浓度为0.1mM)，转至16℃，250rpm的转速培养24h，诱导5-羟甲基糠醛氧化酶蛋白表达。然后置于5000rpm的转速下离心5min收集菌体细胞，在去除培养基后加入200μL细胞裂解液，常温下充分震荡1h。最后置于5000rpm的转速下离心15min，从每个孔中取50μL含5-羟甲基糠醛氧化酶蛋白的上清液于96孔酶标板中。向酶标板中加入含有10mMHMF底物的150μL反应液，置于酶标仪中，利用kinetic模式测定每个孔在560nm波长下的光吸收增加值，比较每个孔中酶的活性(图3)。结果表明，在每一个含有pTrcHis-B质粒的孔中均检测到了明显的活性，表明本方法能成功检测5-羟甲基糠醛氧化酶对底物HMF的活性。更重要的是，每个孔中的酶活性值基本一致，不同孔间的标准误差仅为5％，表明本方法带来的实验误差非常小，可用于高通量的活性筛选。实施例3：参照实施例2的方法和步骤获得含5-羟甲基糠醛氧化酶蛋白的粗酶液，取50μL粗酶液于96孔酶标板中。向96孔酶标板中加入含有10mMFFCA底物的150μL反应液，半小时后置于酶标仪中，利用endpoint模式测定每个孔在560nm波长下的光吸收值，比较每个孔中酶的活性(图4)。结果表明，在每一个含有pTrcHis-B质粒的孔中均检测到了明显的活性，表明本方法能成功检测5-羟甲基糠醛氧化酶对底物FFCA的活性。同样，每个孔中的酶活性值基本一致，不同孔间的标准误差仅为8％，表明本方法带来的实验误差非常小，可用于高通量的活性筛选。实施例4：使用引物F：5’-GGGAATTCCATATGACTGATACGATTTTTGAC-3’和R：5’-CGCGGATCCTTAAGCCTGGGTCAGAATC-3’，以pTrcHis-HMFO质粒DNA为模板，利用易错PCR，构建HMFO随机突变体库。PCR反应体系如下：10×Taqbuffer5μL，MgCl21.5mM，dNTP0.4mM，DNA模板10ng，DMSO3％，上下游引物各0.5μL、MnCl20.01mM，ddH2O补至50μL。将PCR片段导入表达载体p本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种5‑羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、过夜培养：在96孔培养板的孔中均放入100～120μL LB培养基，挑取含5‑羟甲基糠醛氧化酶基因的菌株单克隆依次放入孔中，再将96孔培养板放入摇床，在37～40℃的温度下以250～300rmp的转速培养16～20h；步骤二、诱导培养：向96孔培养板的孔中均加入100～120μL且浓度为0.1～0.5mM IPTG的诱导剂，在16～18℃培养20～24h；步骤三、离心收集：在5000～6000rmp的转速下离心5～10min，然后收集细胞菌体，去除培养基和诱导剂，加入150～200μL的细胞裂解液，并在20～25℃的温度下以5000～6000rmp的转速震荡1h；步骤四、二次离心：在5000～6000rmp的转速下离心15～20min；步骤五、提取上清液与显色反应液：从96孔培养板的每个孔中取20～50μL含5‑羟甲基糠醛氧化酶蛋白的上清液置于96孔酶标板中，然后在96孔酶标板中加入含有90～100mM磷酸缓冲液、1～20mM底物和10～20μM 10‑acetyl‑3,7‑dihydroxyphenoxazine与6～10U/mL辣根过氧化物酶的显色反应液；步骤六、检测：将96孔酶标板放入酶标仪中，在560～580nm波长下测定不同时间的光吸收值。...
【技术特征摘要】
1.一种5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、过夜培养：在96孔培养板的孔中均放入100～120μLLB培养基，挑取含5-羟甲基糠醛氧化酶基因的菌株单克隆依次放入孔中，再将96孔培养板放入摇床，在37～40℃的温度下以250～300rmp的转速培养16～20h；步骤二、诱导培养：向96孔培养板的孔中均加入100～120μL且浓度为0.1～0.5mMIPTG的诱导剂，在16～18℃培养20～24h；步骤三、离心收集：在5000～6000rmp的转速下离心5～10min，然后收集细胞菌体，去除培养基和诱导剂，加入150～200μL的细胞裂解液，并在20～25℃的温度下以5000～6000rmp的转速震荡1h；步骤四、二次离心：在5000～6000rmp的转速下离心15～20min；步骤五、提取上清液与显色反应液：从9...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨加伟，程小玲，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52
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