一种提高cyp3A5表达酶代谢活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于酵母的CYP3A5生物反应器及其构建方法，其是通过将人源CYP3A5基因根据酵母密码子的编码偏好进行序列优化，而后利用基因工程技术将序列优化后的人cyp3A5及其氧化还原酶NADPH共转染到酵母工程菌株的基因组中，实现人cyp3A5及NADPH在毕赤酵母中的大量表达，药物通过通透性增加的酵母细胞壁进入胞浆，能够在酵母发酵培育过程中实现对特定药物进行选择性的代谢过程，构建基于基因工程酵母的药物代谢生物反应器，以生物合成的方法高效生产专一的药物代谢物；为药理学、毒理学研究提供了可靠的体外模型，为我国新药开发提供了一个新的研究平台。

A method to improve the metabolic activity of cyp3A5 expression enzyme

The invention discloses a CYP3A5 bioreactor based on yeast and its construction method, which is optimized by sequencing the human CYP3A5 gene according to the coding preference of the yeast codon, and then co transfected to the genome of the yeast engineered strain by using the gene engineering technique to co transfect the sequence optimized human cyp3A5 and its oxidoreductase NADPH. In Pichia pastoris, a large number of human cyp3A5 and NADPH are expressed in Pichia pastoris. The drug can enter the cytoplasm through the yeast cell wall with increased permeability. It can carry out selective metabolic process to specific drugs during yeast fermentation and construct a biosynthetic bioreactor based on genetic engineering yeast. The method provides a reliable in vitro model for pharmacology and toxicology, which provides a new research platform for the development of new drugs in China.

【技术实现步骤摘要】
一种提高cyp3A5表达酶代谢活性的方法
本专利技术属于基因工程
，更具体地，本专利技术涉及一种检测重组表达酶CYP3A5底物代谢活性的方法。
技术介绍
在新药研究与开发过程中，药物的吸收、分布、代谢、排泄及其毒性(ADME/Tox)特征对于一个药物候选物最终成功起着至关重要的作用。细胞色素酶(cyp450)是非常重要的药物代谢I相酶，目前市面上大于85％的药物在人体内是由cyp450来代谢。传统的药物代谢研究以实验动物体内实验为主。近几年来，药物早期代谢研究进入到体外代谢的研究阶段：即利用重组cyp450酶在异源表达系统中进行表达，建立起体外筛选体系，进行体外代谢数据和性质到体内代谢数据和性质的预测，使现代新药研发具有了高通量、高效率、高准确性的特点。利用构建好的CYP药物体外筛选系统通过测定药物代谢的动力学参数及其产物性质，预测cyp450体内代谢水平，这是目前欧美各国在进行新药申报时必须进行的一项研究。同时，美国FDA已对新药研发提出门槛更高的建议：对于大于药物总量的10％的代谢物要单独做毒性实验，当一种药物被cyp450酶代谢成数种活性代谢物时而且又是毒性活性代谢物，明显影响组织或靶组织反应时，应主要测定代谢物的浓度。因此，对代谢物进行定性和定量，是药物毒性评价和代谢动力学研究中最重要的步骤。但这些代谢物往往是毫克级的，运用标准的化学合成途径，需要鉴定其结构，分离其在化学合成中产生的异构体，通常非常复杂，合成过程需要数周，需消耗大量的人力物力。因此，利用酵母生物反应器进行生物合成代谢物，是传统的化学合成方法一个很好的替代手段，并且更具优势。设想将人CYP450基因主要亚型(CYP3A4、CYP3A5、CYP2A6、CYP2C8以及CYP2C19)整合进生物体内，实现人CYP450基因主要亚型的稳定表达，以期能够在生物代谢过程中实现对特定药物的选择性代谢，生产专一的药物代谢物。可以对用生物方法生产专一的药物代谢物进行初步研究，同时为药理学、毒理学研究提供可靠的体外模型。在近年的研究中，用异源表达人CYP450s对药物代谢物的研究正逐渐成为热点，因为利用生物生产药物代谢物可能会是对传统的化学合成方法良好的替代手段并且更具环保优势。CYP3A5的活性有很大的个体和种族差异性。CYP3A5代谢差异会造成药物利用度和清除率的差异，从而使药物疗效和毒性产生差异。在肝脏CYP3A5含量占CYP3A总量的一半以上。同时CYP3A5在肠、食管、胃、胆囊等多种器官和组织中表达，这也可能是其重要性的体现。CYP3A5在肿瘤组织中也有表达，增加了肿瘤组织中CYP3A的表达，提示可能与CYP3A5和肿瘤的发生和治疗有关，另外器官移植手术病人的免疫抑制剂的代谢也与CYP3A5多态性有重要关系。然而，人CYP450酶系是一种膜蛋白，只能在胞内表达，药物需要进入细胞内才能被利用。酵母细胞壁却成为一道屏障，它能阻止大分子化学物质进入细胞。为了成功构建基于酵母的人CYP450体外表达模型，在酵母发酵过程中研究药物代谢情况，增加酵母细胞壁的通透性是使大分子药物能顺利通过细胞壁的有效途径。CYP450代谢产物的生产目前基本采用化学合成方法，对合成的化合物需要一一鉴定其结构，分离其在化学合成中产生的异构体，通常非常复杂，合成过程需要数周，需消耗大量的人力物力。
技术实现思路
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种提高重组人源cyp3A5酵母His+Mut+生物反应器的cyp3A5表达酶代谢活性的方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采取了以下技术方案：一种提高重组人源cyp3A5酵母His+Mut+生物反应器的cyp3A5表达酶代谢活性的方法，所述方法是在活体重组人源cyp3A5酵母His+Mut+生物反应器中进行的，包括以下步骤：(1)、将冻存的重组人源cyp3A5酵母His+Mut+生物反应器进行活化，经传代扩培后，酵母大量增殖；(2)、甲醇诱导培养60～72h后，往BMMY培养基中加入3～6％的乙醚，同时加入100ul1mmol/L的睾酮24h-48h后，离心，分别收集上清和细胞；(3)、用乙腈重悬细胞，超声破碎后，离心收集上清，即可进行检测。在其中一些实施例中，所述重组人源cyp3A5酵母His+Mut+生物反应器是通过以下步骤构建得到的：(1)、用XbaI酶切质粒pBS-2A，分别回收3.0kbPBS骨架片段和130bp的2A连接肽片段，将3.0kb骨架片段去磷酸化处理，重新连接选择反向克隆即得到载体pBS-2A(-)；将NADPH-细胞色素P450氧化还原酶基因POR定向插入所述载体pBS-2A(-)的BglII及NotI酶切位点之间，获得载体pBS-2A-POR；序列优化后的人源cyp3A5经PCR加A回收，两端带BamHI+XbaI，将其连接到PMD-19Tsimple，得到CYP3A5–PMD19Tsimple，将.CYP3A5–PMD19Tsimple和pBS-2A-POR分别用BamHI+XbaI双切处理，CYP3A5连接到pBS-2A-POR，得到载体pBS-CYP3A5-2A-POR；将载体pBS-CYP3A5-2A-POR进行BamHI和NotI双酶切，获得片段CYP3A5-2A-POR，将该片段插入酵母表达载体pPIC3.5K的BamHI/NotI位点，获得双表达载体pPIC-CYP3A5-2A-POR；(2)、将双表达载体pPIC-CYP3A5-2A-POR线性化后，乙醇进行回收；(3)、将感受态毕赤酵母GS115和线性化双表达载体pPIC-CYP3A5-2A-POR的混合物转移至预冷的BIO-RAD电转杯中，冰浴5～15min；进行电击；结束后立即加入冷的1M山梨醇溶液等待涂板；(4)、MD初步筛选重组转化子后，再经PCR筛选重组转化子，经SDS-PAGE和Westernblot法检测目的蛋白，即得重组人源cyp3A5酵母His+Mut+生物反应器。在其中一些实施例中，所述步骤(3)中双表达载体线性化是采用SalI酶进行的。在其中一些实施例中，所述步骤(3)中线性化的反应体系为：双表达载体30μL、10×BufferH5μL、SalI酶5μL、ddH2O10μL。在其中一些实施例中，所述步骤(3)中乙醇回收的步骤为：向50μL已反应结束的体系中加入125μL体积的预冷的无水乙醇，然后加入冷的5μL的3M，PH＝5.2的醋酸钠溶液，在-20℃放置1h；12000rpm离心10min，然后用1mL75％的酒精洗涤两次，12000rpm离心5min，烘干，用10～20μL超纯水溶解沉淀。在其中一些实施例中，步骤(4)中所述感受态毕赤酵母GS115和线性化双表达载体pPIC-CYP3A5-2A-POR的体积比为1：1。在其中一些实施例中，步骤(4)中所述电转化参数为：电压1.5KV，电容25μF，电阻200Ω，正常放电时间Tc：4.2～4.9ms。在其中一些实施例中，步骤(5)中所述PCR的扩增引物为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术的提高重组人源cyp3A5酵母His+Mut+生物反应器的cyp3A5表达酶代谢活性的方法不破碎重组酵母本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高重组人源cyp3A5酵母His+Mut+生物反应器的cyp3A5表达酶代谢活性的方法，其特征在于，所述方法是在活体重组人源cyp3A5酵母His+Mut+生物反应器中进行的，包括以下步骤：(1)、将冻存的重组人源cyp3A5酵母His+Mut+生物反应器进行活化，经传代扩培后，酵母大量增殖；(2)、甲醇诱导培养60～72h后，往BMMY培养基中加入3～6％的乙醚，同时加入100ul1mmol/L的睾酮24h‑48h后，离心，分别收集上清和细胞；(3)、用乙腈重悬细胞，超声破碎后，离心收集上清，即可进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种提高重组人源cyp3A5酵母His+Mut+生物反应器的cyp3A5表达酶代谢活性的方法，其特征在于，所述方法是在活体重组人源cyp3A5酵母His+Mut+生物反应器中进行的，包括以下步骤：(1)、将冻存的重组人源cyp3A5酵母His+Mut+生物反应器进行活化，经传代扩培后，酵母大量增殖；(2)、甲醇诱导培养60～72h后，往BMMY培养基中加入3～6％的乙醚，同时加入100ul1mmol/L的睾酮24h-48h后，离心，分别收集上清和细胞；(3)、用乙腈重悬细胞，超声破碎后，离心收集上清，即可进行检测。2.根据权利要求1所述的提高重组人源cyp3A5酵母His+Mut+生物反应器的cyp3A5表达酶代谢活性的方法，其特征在于，所述重组人源cyp3A5酵母His+Mut+生物反应器是通过以下步骤构建得到的：(1)、用XbaI酶切质粒pBS-2A，分别回收3.0kbPBS骨架片段和130bp的2A连接肽片段，将3.0kb骨架片段去磷酸化处理，重新连接选择反向克隆即得到载体pBS-2A(-)；将NADPH-细胞色素P450氧化还原酶基因POR定向插入所述载体pBS-2A(-)的BglII及NotI酶切位点之间，获得载体pBS-2A-POR；序列优化后的人源cyp3A5经PCR加A回收，两端带BamHI+XbaI，将其连接到PMD-19Tsimple，得到CYP3A5–PMD19Tsimple，将.CYP3A5–PMD19Tsimple和pBS-2A-POR分别用BamHI+XbaI双切处理，CYP3A5连接到pBS-2A-POR，得到载体pBS-CYP3A5-2A-POR；将载体pBS-CYP3A5-2A-POR进行BamHI和NotI双酶切，获得片段CYP3A5-2A-POR，将该片段插入酵母表达载体pPIC3.5K的BamHI/NotI位点，获得双表达载体pPIC-CYP3A5-2A-POR；(2)、将双表达载体pPIC-CYP3A5-2A-POR线性化后，乙醇进行回收；(3)、将感受态毕赤酵母GS115和线性化双表达载体pPIC-CYP3A5-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴仁科，王珍玉，戴天明，江伟凡，郭佳音，邓继峰，张伟，郭子钲，
申请(专利权)人：中山珐玛斯医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44